Angew：构建靶向内质网的DNA纳米装置，用于膜结合细胞器中蛋白质的自噬依赖性降解

导读

近日，华东理工大学钱旭红院士、杨泱泱教授团队报道了一种通过自噬依赖性途径，经历新的细胞内降解的新型DNA纳米装置，该装置用于特异性捕捉内质网（ER）定位的蛋白质，并将其运输至溶酶体进行降解。这种DNA纳米装置既能高效降解外源性的ER驻留蛋白（ER-eGFP），又能降解癌细胞中过表达的分子伴侣（葡萄糖调节蛋白78）。文章链接DOI: 10.1002/anie.202205509

正文

蛋白质是细胞中最丰富的生物分子，其生物/病理功能与亚细胞定位密切相关。例如，内质网（ER）是一种必不可少的膜结合细胞器（MBO），具有独特的化学环境，可以在伴侣分子和折叠酶的帮助下进行蛋白质的折叠和修饰。蛋白质的错误折叠和异常蛋白质表达可能会引起ER应激，进而引起癌症和神经退行性疾病。通过采用包括泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬系统的细胞蛋白质质量控制系统，靶向蛋白降解（TPD）策略已成为具有代表性的蛋白质消除工具。

纳米材料的最新研究进展提供了大量可以靶向亚细胞区室的候选材料。其中，DNA纳米结构因其可编程的自组装性，广泛的功能性及高生物相容性，而被认为能够作为参与疾病治疗的治疗载体。此外，DNA纳米结构已被证实可作为靶向细胞器，生物传感和细胞凋亡等工具。Krishnan课题组开发了一系列用于检测细胞器内离子变化的DNA纳米装置。仰大勇团队报道了一种DNA纳米结构，实现了线粒体干扰。然而，其他MBO靶向DNA纳米装置还未有报道。

本文描述了一种ER靶向DNA纳米结构用于消除大多数癌细胞中ER上过表达的定位蛋白。该文使用肽-寡核苷酸偶联作为人工膜受体（AMR）, AMR可以将自身插入到细胞膜上。随后，含有AMR互补序列链的凹形DNA装置（cDOS）通过与AMR杂交锚定在细胞表面，开启cDOS的跨膜摄取。本文证明了AMR引导能够快速有效的运送cDOS，并且cDOS在体内逃逸后靶向到内质网，随后经过自噬依赖性的途径到溶酶体进行降解。基于以上的发现，该课题组提出使用亚细胞靶向cDOS去构建程序化的MBO定位蛋白降解系统，用于调节包括外源性ER-驻留蛋白（ER-eGFP）和内源性过表达分子伴侣（葡萄糖调节蛋白78）在内的蛋白质的丰度（图1）。

图1. 靶向内质网的DNA纳米装置，用于降解膜结合细胞系中的蛋白质(图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.)

凹形DNA折纸结构（cDOS）由179个短链DNA及M13mp18支链在四步过程中混合，退火合成。随后离心三次去除多余的短链，最后使用琼脂糖凝胶电泳和透射电子显微镜来分析cDOS（图2a,b,c）。pH低插入肽（pHLIPs）是在酸性条件下，能够形成跨膜 a-螺旋并将自身插入细胞膜的一系列相应肽。本文制备了pHLIPs-寡核苷酸偶联物（pHLIP-ON）作为AMR，并用于cDOS内化。5’-炔烃连接的寡核苷酸与叠氮连接的pHLIP通过铜(Ⅰ)催化叠氮化物-炔烃环加成过程合成pHLIP-ON（图2d）。

图2. (a)(b)(c)凹形DNA 折纸结构表征图，(d) pHLIP-ON 合成过程，(e) FAM-pHLIP-ON 分别在pH=7.4, pH=6.5下细胞膜插入性能(图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.)

为了评估pHLIP-ON的膜插入能力，将其与FAM修饰的单链DNA（FAM-ssDNA）杂交，形成双链FAM-pHLIP-ON。作者首先优化了培养环境的pH（弱酸性或正常条件下）（图2e），评估了膜锚定pHLIP-ON用作cDOS内化的AMR向导的潜力。实验结果表明pHLIP-ON 可以在弱酸性微环境下被作为特定的AMR, 并在杂交时承载cDOS (图3a,b,c)。随后，使用定量实时PCR (qPCR)实验检测了体系中存在或不存在AMR时，细胞对cDOS的摄取效率。结果显示，与单独的cDOS相比，在AMR协助下，细胞内定位过程中cDOS的摄取效率增加了大约18倍（图3d）。

由于低pH是肿瘤细胞的微环境的共同特征之一，因此该策略可能更适用于靶向癌细胞而不是健康细胞。为了证实这一推测，作者选用两种癌细胞（MCF-7和HepG2）一种健康细胞（DC2.4）来进行验证。如图3e，在弱酸性的培养微环境下，cDOS在MCF-7和HepG2细胞中均能观察到有效内化，而在健康细胞DC2.4细胞内未观察到内化。

图3. (a) FAM-cDOS在弱酸性条件下与预锚定AMR杂交，内化示意图, (b) 弱酸性条件下 (pH=6.5), (c) 正常条件下 (pH=7.4) cDOS的跨膜性能，(d) cDOS 在存在或不存在AMR下，细胞对cDOS摄取效率。(e) cDOS在癌细胞与健康细胞中内化情况(图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.)

随后，实验确定了cDOS的内吞途径主要是小窝蛋白依赖性介导途径。并通过共定位检测后，确定了cDOS跨膜后的走向。如图4a,c显示，cDOS被内吞4到6h后，其主要集中在内质网上。在被内吞6h后，内质网和高尔基体上的cDOS逐渐转移至溶酶体（图4b）。并在孵育12h后，cDOS有效的转移至溶酶体进行降解（图4d）。实验证实了cDOS在内吞后，能够有效的靶向ER，这是DNA纳米结构首次在没有任何亚细胞靶向配体的帮助下显示出亚细胞靶向能力。

图4. cDOS在不同时间 (4、6和12小时) 在不同细胞器（ER和溶酶体）中的细胞间运输情况(图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.)

最后，作者选用了包括外源性ER驻留eGFP和内源蛋白（葡萄糖调节蛋白78）两种ER定位蛋白，分析该系统的可行性及降解效率。实验结果表明，cDOS介导的蛋白质降解系统可用于自噬-溶酶体途径进行细胞器定位的蛋白质降解。此外，将该系统与特定的肿瘤微环境响应配体相关联可以引导和促进细胞器定位蛋白质降解，增强肿瘤选择性。

总结

钱旭红院士团队开发了一种DNA纳米装置，旨在降解MBO定位的蛋白质。这种方法通过DNA纳米装置与蛋白质靶向配体作为弹头的程序组装构建，随后将该组件用于靶向到ER定位的蛋白质上并携带它们进行溶酶体降解。该方法表现出外源和内源ER定位蛋白的高降解效率。同时为调节细胞蛋白质的丰度提供了新的见解，并可能加速癌症治疗的发展。

文献详情：

Caixia Liu, Bin Wang, Weiping Zhu, Yufang Xu, Yangyang Yang*, Xuhong Qian*, An ER‐targeting DNA Nanodevice for Autophagy‐dependent Degradation of Proteins in Membrane‐bound Organelles. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, https://doi.org/10.1002/anie.202205509