新冠疫苗研发现状：亚单位疫苗研究概览

自1931年至今，人类历史上爆发过多次高致病性疾病，大多由病毒引起（见图1），给人类社会造成了巨大的负担，而疫苗则是防治疾病最有效的手段。SARS-CoV-2从2019年12月爆发至今，波及全球216个国家和地区，科学界和制药界的巨大努力促成了COVID-19 疫苗的设计、测试和成功部署。尽管如此，SARS-CoV-2变异迅速，先后出现了alpha株、Beta株、Delta株及Omicron株等，并且仍在持续变异[1]。

1.SARS-COV-2的蛋白结构

新冠病毒病毒复制过程中，产生31种蛋白，包括4种结构，11种辅助蛋白（ORF蛋白），16中非结构蛋白（nsp1~nsp16），结构蛋白包括：刺突糖蛋白（S，Spike Protein），包膜糖蛋白（E，Envelope Protein）和膜糖蛋白（M，Membrane Protein）和核衣壳蛋白（N，Nucleocapsid Protein），见图2。S蛋白，主要是RBD区域被认为含有丰富的抗原表位，能有效引起机体体液免疫应答和细胞免疫应答，是疫苗开发的重点关注靶点。

图2 新冠病毒基因组、结构及模式图

2.SARS-CoV-2的抗原位点研究现状

CD4+T细胞的反应主要针对S、M和N蛋白，并部分针对nsp3、nsp4和ORF8。CD8+T细胞可识别M、N、S蛋白、nsp6和ORF3a。ORF8能够下调不同细胞类型上MHC-I的表达。RBD区能够诱导强烈的中和抗体，且不会产生ADE（Antibody-Dependent Enhancement，ADE）[2]。因此，RBD是SARS-CoV-2疫苗的一个很有前景的靶点。除了S蛋白之外，其他蛋白，如N蛋白、M蛋白、非结构蛋白(nsps)和辅助蛋白，可能有潜力作为抗原。N蛋白可以诱导保护性的CTL，中和抗体滴度与N个蛋白特异性T细胞的数量显著相关，NAbs的产生可能与抗病毒T细胞的激活有关。

新冠疫苗研发有五种路线，包括腺病毒载体疫苗、灭活疫苗、单位疫苗、mRNA疫苗及减毒活疫苗，而本文将重点讲述亚单位疫苗。

3.SARS-CoV-2的构象及对亚单位疫苗设计的影响

在SARS-CoV-2中，RBD通过与细胞表面ACE2受体结合，触发复杂的构象变化，驱动S蛋白从融合前构象转变到融合后构象，从而进入细胞，见图3。S蛋白可以在S1-S2和S2’裂解位点进行蛋白裂解，释放对FP的结构限制。RBD与其细胞受体，人血管紧张素转换酶2(hACE2)的结合，导致S1亚基的解离，并同时启动弹簧加载的S2亚基的重新折叠过程，它在其末端突出用于进行膜融合。融合后的S2亚基折叠成一个长螺旋束，FP插入宿主细胞膜。理论上，nAbs可以靶向S蛋白，以在病毒进入过程中的多个阶段抑制病毒感染。大多数针对SARS-CoV-2的有效nAbs靶点是RBD。关于疫苗的设计，对以前的冠状病毒的研究发现，在S2的中心螺旋中添加两个脯氨酸(2P)稳定了RBD的“up”构象。因此，引入这种合成的S-2P，就优化了抗体对感染性病毒颗粒的反应，S-2P基序现在被BNT/Pfizer，Moderna， Novavax和Janssen/J&J使用。将S1-S2连接中的FCS残基从RRAR改为QQAQ，使蛋白抵抗蛋白酶，这个3Q基序被Novavax使用。S蛋白的灵活性也使它能够在与同源目标受体融合前后改变形状。融合后的S呈针状，刚性，隐藏了RBD表位，从而通过诱导非中和抗体来逃避免疫反应[3]。

4.SARS-CoV-2亚单位疫苗研究现状

目前报道的大多数新冠候选疫苗都是基于全长S蛋白。虽然全长S蛋白基疫苗可以诱导中和抗体和/或保护性免疫，但由于新冠S蛋白天然构象为三聚体，正常表达S蛋白全长时表达量过低，无法实现大规模工业化生产，但是去除跨膜结构域和胞内段后S蛋白又只能以单体形式分泌到胞外，但是免疫原性较低。因此能够使S蛋白形成三聚体并分泌至胞外是新冠亚单位疫苗研发的难题。

目前临床前或上临床的亚单位疫苗大多是S蛋白三聚体或RBD二聚体形式存在，均具有良好的免疫原性，见表1。现以临床效果较好的几种疫苗为例，阐明其效果。

表1 新冠亚单位疫苗临床研究进展

4.1 S-Trimer

三叶草生物在CHO细胞中利用三聚体标签技术表达新冠S-Trimer（~700 kDa），配以AS03或 CpG 1018+铝佐剂，在动物模型中诱导了高水平的中和抗体和Th1偏向的细胞免疫反应。S-Trimer蛋白纯化是利用三聚体标签和Endo180（一种能够结合C端的human Type I(α) collagen（aa1156-1406））之间的高结合亲和力，Protein A 亲和柱用带Endo180-Fc 的MabSelect PrismA (GE Healthcare) 进行预装载，并通过Endo180和Trimer tag之间的高亲和力结合被树脂捕获。将由CHO细胞分泌的含有S-Trimer培养液与预捕获的Endo180-Fc一起装载到Protein A柱上。洗去未结合部分后，使用含0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲盐水洗脱S-Trimer。S-Trimer使用醋酸进行低pH（pH3.5)病毒失活（VI)后，将pH调整到中性范围，然后以流动方式加载CaptoQXP树脂(GE BioSceines)去除宿主细胞DNA和剩余宿主细胞蛋白，最后浓缩。S-Trimer在2-8°C可稳定保存至少6个月。

此外还有T4噬菌体折叠结构域（T4-Fd：MQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPA）、GCN4（MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV）等均可以帮助S蛋白形成天然三聚体构象。但是由于引入了非人源化蛋白，因此使用受到限制[4]。

4.2 智飞生物RBD二聚体

ZF2001 RBD的两个单体被串联为重复二聚体，在CHO细胞中表达。RBD-二聚体亲和力与RBD-单体相似，表明受体结合基序的正确暴露。该疫苗含有串联重复序列二聚体受体结合域53(RBD)蛋白。疫苗在小鼠和非人类灵长类动物(NHPs)中的免疫原性和有效性。ZF2001在小鼠和NHPs中诱导了高水平的RBD结合和SARS-CoV-2中和抗体，并且在NHPs中诱导了平衡的TH1/TH2细胞反应。两种剂量的ZF2001保护Ad-hACE2转导的小鼠免受SARS-CoV-2感染，减少病毒RNA，减轻了肺损伤。在NHPs中，接种25μg或50μg ZF2001疫苗可预防肺、气管和支气管中的SARS-CoV-2感染，肺部病变较轻。在两种模型中均未观察到疾病增强的证据。已批准在乌兹别克斯坦紧急使用[5]。

4.3 NVX-CoV2373

SARS-CoV-2亚单位疫苗(NVX-CoV2373)为全长S蛋白融合前构象稳定。NVX-CoV2373S形成27.2nm的纳米颗粒，具有耐热性，并与人血管紧张素转换酶2(hACE2)受体具有高亲和力的结合。在小鼠中，低剂量NVX-CoV2373与Matrix-M佐剂可诱导高滴度抗sIgG，阻断hACE2受体结合，中和病毒，并保护其免受SARS-CoV-2感染，没有证据表明疫苗相关的增强呼吸道疾病。NVX-CoV2373还能在脾脏中诱导多功能的CD4+和CD8+T细胞、CD4+滤泡辅助T细胞(Tfh)和抗原特异性生发中心(GC)B细胞。在狒狒中，低剂量水平的含有Matrix-M佐剂的NVX-CoV2373也具有高度的免疫原性，并诱导高滴度的抗S抗体和功能性抗体，阻断S蛋白与hACE2的结合，并中和病毒[6]。

4.4 纳米颗粒疫苗

使用自组装的铁核素纳米粒子设计了亚单位候选疫苗，构建了全长ectodomain (S-Fer) 和 C端70aa缺失的SΔC-Fer。分别对小鼠进行一次免疫后，SARS-CoV-2假病毒试验显示，平均中和抗体滴度至少是Covid-19患者恢复期血浆的2倍。此外，与单独免疫RBD单体或S-ectodomain三聚体相比，单个剂量的SΔC-Fer可产生明显更高的中和反应。

利用铁蛋白纳米球作为支架，设计了一种基于RBD的亚单位疫苗。通过合成不同大小的接头将RBD连接到不同的铁蛋白纳米胶囊(H-铁蛋白和L-铁蛋白)，通过设计了几种融合蛋白构建体。利用分子动力学模拟(MDS)测试了其稳定性和动力学。根据MDS分析，五种氨基酸为基础的短接头是在铁蛋白表面显示RBD最有效的方法[7]。

5.总结与展望

新冠亚单位疫苗抗原设计理念在免疫原性最大化方面发挥着重要作用。疫苗设计时需要尽可能涵盖重要的中和表位表位。此外，免疫原的结构设计还需要进一步的研究。使用合适的递送系统也对疫苗的有效性至关重要。确定哪种方法效果最好取决于许多因素，包括疫苗的类型和疫苗接种途径。此外，应在各种类型的疫苗中添加佐剂，以增强免疫原性；因此，选择适当的佐剂对开发SARS-CoV-2疫苗至关重要。然而，对于最能诱导SARS-CoV-2保护性免疫的最佳佐剂，尚未达成共识。佐剂的选择应考虑到对新冠病毒疫苗开发至关重要的抗体的大小、亲和力、同型和持久性。

铝盐佐剂是第一个获得许可用于人类疫苗的佐剂。由于其能广泛增强免疫反应和良好的安全性，仍然使用最广泛。嗜酸性免疫病理反应通常被认为是Th2反应的产物，但最近的研究表明，组织嗜酸性粒细胞增多也可以由Th17反应来控制。因此正确选择佐剂可使免疫反应偏离Th17反应。在冠状病毒疫苗研究中，佐剂，如铝盐、乳液和toll样受体(TLR)激动剂，已被用于各种动物模型的研究。其中佐剂AS03、MF59和CPG1018已被许可用于疫苗，在新冠疫苗的研发中，也已经被广泛研究。不同佐剂特性及其在SARS-CoV-2疫苗中的研究现状汇总详细见表2。

表2 冠状病毒疫苗佐剂

参考文献

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