植物生长素研究迎重大突破：中国科学家阐明生长素极性运输的分子机制，为开发新型小分子抑制剂奠定基础

　　粮食安全，是国之大事。要想秋收满谷仓，除草剂农药必不可少。只有除掉杂草才能保证作物的良好成长。而若想研发高效的除草剂，必须对杂草也就是植物进行研究。

　　近日，浙江大学团队联合湖北大学，实现了植物生长素极性运输研究的重大突破，让植物向性这一百年科学难题的关键一环得以解决，为生长素极性运输的进一步调控打下基础。近日，相关论文发布在 Nature 上。

　　担任共同通讯作者的浙江大学医学院生物物理系长聘副教授/附属第四医院双聘教授表示：“对于弄清楚 PIN 蛋白（pin-formed protein）介导生长素转运的分子机制，学界早已翘首以盼，而该工作终于揭晓这一机制。这为开发基于结构靶向 PIN 家族蛋白的新型小分子抑制剂奠定了基础。这些抑制剂既能作为工具，去研究生长素的极性运输机理；也可作为农业除草剂，助力于作物改良。”

　　图 | 浙江大学研究团队主要成员合影。前排左起：郭逸蓉、张素芬、张艳、苏楠楠、竺爱琴、；后排左起：周晨羽、叶繁、郑绍建、、常圣海

　　同时，作为共同作者单位的湖北大学，也借此迎来该校第一篇 Nature 论文。审稿人评价称：本文报道了一个重要的结构，为植物生长素运输提供了新的研究思路；这些发现是开创性的，真正为 PIN 蛋白的功能提供了新的见解，从而为研究打开了许多新的途径。此外，PIN 蛋白与胆汁酸/钠转运蛋白的结构也存在有趣的相似性，这可能有助于更好地理解 PIN 蛋白的起源及其转运机制。

　　另据悉，通过比对拟南芥其他生长素转运蛋白序列，课题组发现生长素转运位点是保守的，这种保守性也会延伸到其他的植物物种中。因此，可以认为此次研究结论，也能被推广到其他植物中。

　　近日，相关论文以《拟南芥生长素转运蛋白 PIN3 的结构与机制》（）为题发表在 Nature 上[1]。

　　图 | 相关论文（来源：Nature）

　　共同通讯作者分别为、浙江大学医学院生物物理学系研究员、以及湖北大学生命科学学院&省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室教授。团队的博士后苏楠楠、课题组的博士生竺爱琴、以及团队的博士生陶鑫为论文共同一作。

　　PIN 蛋白在拟南芥中介导生长素极性运输机制

　　据介绍，生长素对植物的生长发育起核心调控作用。一般来讲，低浓度的生长素促进生长，高浓度的生长素抑制生长。生长素主要合成部位是在芽、幼嫩的叶和发育中的种子，然后被运输到作用部位。

　　其中，生长素调控植物生长发育与其在植物各个组织中的不对称分布有着密切的关系。而这种不对称分布，主要由于在细胞与细胞之间的生长素运输具有一定的方向性，这也被称为生长素极性运输（Polar Auxin Transport，PAT）。

　　那么，PIN 蛋白缘何能导致植物具有向光性？植物的向光性，是指植物受到单侧光的刺激而引起的生理弯曲现象。而植物体内生长素的不对称分布，和这种向光性息息相关。

　　生长素在植物体内运输有两条途径：一是通过韧皮部完成长距离运输的非极性运输；二是需要转运蛋白参与的单方向极性运输。

　　其中，对于生长素的不对称分布，极性运输起着关键作用。PIN 蛋白可以将生长素转运至细胞外。PIN 蛋白在细胞膜上的极性定位，决定着植物体内生长素极性分布，从而会导致植物的向光性。

　　至于为何要采用拟南芥作为研究对象？表示，拟南芥作为模式植物，其基因组已于 2000 年由国际拟南芥基因组合作联盟完成测序，是第一个实现全序列分析的植物基因组。

　　目前，人们已在 30 多种植物中鉴定出了不同数量的 PIN 基因。作为模式植物，拟南芥中有 8 个 PIN 蛋白成员（PIN1-PIN8）。

　　学界在这方面的生物学功能研究，也比针对植物其他物种的研究更透彻，这能帮助该团队更好地认识 PIN 蛋白的生化、生理以及遗传等特征。同时，鉴于本研究旨在研究植物生长素的极性运输机制，因此其选择拟南芥为研究对象。

　　据介绍，生长素极性运输主要依赖于三种膜定位转运体：AUX/LAX 家族蛋白、 PIN-FORMED 家族蛋白和 ABCB 家族蛋白。

　　通过调控这些家族蛋白，植物可以调节生长素的极性运输和分布。研究发现，拟南芥 PIN 与 ABCB 蛋白可以共同定位。而通过酵母双杂交和免疫共沉淀的实验表明，PIN 和 ABCB 蛋白存在直接的物理互作。

　　PIN 蛋白在极性胚胎发育和器官形成等需要定向生长素极性运输的过程中其决定作用，而 ABCB 则在顶端组织生长素转运及长距离运输中起重要作用，二者在调控生长素的转运上具有一定的独立性。

　　AUX 蛋白为生长素转入蛋白，PIN 蛋白为生长素外排蛋白。它们通过协同工作，一起维持植物体生长素平衡。

　　（来源：课题组）

　　解析三个高分辨率冷冻电镜结构

　　本研究最开始且关键的一环是课题选择，首先通过大量的文献调研，课题组确定了研究对象——PIN 蛋白。

　　PIN 蛋白是生长素转运蛋白，在植物的生长素极性运输方面发挥了巨大作用。因此，研究人员希望通过结构生物学的手段解释PIN蛋白介导的生长素极性运输的分子机制。

　　而拟南芥 PIN 蛋白家族被分为两个亚家族，一类是定位在质膜上的 long PINs （PIN1–PIN4、PIN6 和 PIN7），另一类是定位在内质网上的 short PINs （PIN5 和 PIN8），这两大家族通过共同工作，一起维持着植物生长素的内稳态。

　　研究中，该团队首先对 7 个 AtPINs （AtPIN1–5, AtPIN7–8）进行表达纯化筛选，最终选择 AtPIN3 作为研究对象。原因在于，AtPIN3 与其他 long AtPINs 有至少 54% 的序列同源性，可作为 PIN 家族结构和功能分析的模型。

　　随后，通过哺乳动物细胞 HEK293 外源表达系统、对 PIN 蛋白进行过表达并纯化后，课题组得到了均一且稳定的蛋白样品。

　　借助单颗粒冷冻电镜技术，该团队解析了三个高分辨率冷冻电镜结构，分别处于三种状态：PIN 蛋白未结合底物状态、底物 IAA 结合状态以及抑制剂 NPA 结合状态。

　　接下来是功能实验验证阶段。研究团队建立了体外放射性 3H-IAA 转运实验体系，针对底物 IAA 与抑制剂 NPA 结合位点突变体的生长素转运活性和抑制活性，进行相关的测试。

　　随后又通过表面等离子体共振技术，测试底物 IAA 与抑制剂 NPA 结合位点突变体分别与 IAA 和 NPA 的结合能力。

　　然后，通过功能实验的多重验证，课题组阐明了 PIN 转运蛋白对 IAA 的识别和转运机制，以及抑制剂 NPA 抑制生长素转运的分子机制。最终解释了 PIN 蛋白介导的生长素极性运输的分子机制。

　　（来源：课题组）

　　将探索开发新型农药除草剂

　　在整个研究过程中，研究人员遇到了很多困难。AtPIN3 二聚体的分子量仅为 140 kd，蛋白颗粒取向优势严重，从结构上来看几乎只有跨膜区，这对冷冻电镜数据处理带来了极大的挑战。

　　表示：“从拿到均一稳定的蛋白样品到拿到较好的密度图，经历了大半年的时间。我们通过尝试改善蛋白颗粒的取向优势问题，采用不同的电镜数据处理方法，总结经验，最终得到高分辨率结构。”

　　AtPIN3 与底物 IAA 复合物结构的解析，同样是本研究的一大难点。由于 IAA 与 AtPIN3 亲和力相对较弱，研究团队在前后多次对 AtPIN3 与 IAA 的复合物样品进行单颗粒冷冻电镜数据收集，但是 IAA 的密度一直不是很清晰，这让其无法准确判断 IAA 与 AtPIN3 准确的结合模式。

　　后来，通过提高样品中 IAA 的浓度、更换蛋白样品缓冲液体系、更换冷冻电镜样品载网、制样条件、以及改善样品进孔问题，课题组终于成功拿到复合物高分辨结构。

　　（来源：课题组）

　　通过功能实验对 IAA 和 NPA 的作用机制进行验证也是本研究的难点之一。建立一个准确有效的检测生长素转运的实验体系，对他们来说是一个全新的尝试，经过不断摸索学习总结，最终也成功建立了放射性 3H-IAA 外排实验体系。

　　“从最开始的困难重重到最后柳暗花明的整个研究过程中，我们认识到做研究要有决心，有破釜沉舟的勇气，始终要有把工作做到极致的信念，有做世界最一流工作的信念。”总结称。

　　后续，其计划以 PIN 蛋白为靶点筛选新型小分子抑制剂，并通过体外放射性 3H-IAA 转运实验体系对小分子进行功能验证，也将通过冷冻电镜技术手段解析复合物结构，并在此基础上对筛选的小分子化合物进行优化，进而开发新型除草剂农药。

　　支持：Bao

　　参考资料：

　　1.Su, N., Zhu, A., Tao, X. et al. Structures and mechanisms of the Arabidopsis auxin transporter PIN3. Nature 609, 616–621 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05142-w