实现在活体小鼠肝脏中进行基因组规模的CRISPR筛选

撰文 | Qi

在细胞培养系统中，全基因组筛选的方法有助于识别某个基因在调节细胞过程中的能力，但这种离体系统无法真实重现体内围绕这个细胞过程所发生的所有事件。因此，迫切需要将高通量功能基因组学引入生物体，例如CRISPR-Cas9。虽然以慢病毒为载体已经实现有效地将全基因组sgRNA文库递送至体外培养的数千万个细胞，但其体内递送的效率很低。

小鼠肝脏拥有庞大的细胞数量和多样的代谢功能，不失为基因组规模筛选的有吸引力的目标，但存在转导效率低下和免疫清除等阻碍。之后的工作发现腺相关病毒或流体动力学尾静脉注射法可将sgRNA递送至肝细胞，虽然后者相较于前者而言可以整合到宿主基因组，但由于导入的肝细胞数量有限，也限制了可筛选的基因数量【1-3】。

近日，来自MIT的Kristin A. Knouse团队在Cell Genomoics杂志上发表了一篇题为Genome-scale CRISPR screening in a single mouse liver的文章，他们开发了一种可以将基因组规模的sgRNA文库稳定、高覆盖率地递送到小鼠肝脏，且允许在任意时间点进行Cas9诱导和表型选择的方法，并将其应用于揭示肝细胞适应性调节的正负因子，为活体内的高通量基因组剖析提供了基础。

基于之前的工作，作者假设将高浓度慢病毒静脉注射到新生小鼠体内可能会避免出现低转导效率和免疫清除。为了验证这点，作者构建了编码非靶向sgRNA (sgAAVS1) -mCherry或mTurq2的慢病毒，并把不同剂量的两种等量混合物注射到出生后一天的小鼠中，转导细胞均匀分布且持续到成年期。在此基础上，作者证实这种方法可以应用于Cas9诱导小鼠以实现任意时间点的基因筛选。为了能对不同的肝细胞表型进行基因组规模筛选，作者准备了一个针对在发育中、静止期和再生小鼠肝脏中表达的所有基因的sgRNA文库，利用上述方法对肝细胞适应性进行全基因组筛选，并结合在体外细胞培养实验中确定的数据集来评估所发现的调节因子的可靠性。

图1. 基因组规模的sgRNA在小鼠肝脏中的递送

活体内基因组规模筛选的优势在于能够筛选不携带预先存在的突变的野生型细胞，还可以研究生物性别如何影响基因型和表型之间的关系，当然最有价值的一点还是在于能够在其原生环境中研究表型，因为可以概括细胞与细胞外环境相互作用的所有方式，而在离体培养中是无法完成的。果不其然，作者发现了几个未被记录的对细胞培养至关重要的通路比如抗原加工/呈递和糖胺聚糖生物合成/硫酸乙酰肝素生物合成途径，它们都在蛋白呈递或分泌中发挥重要作用。前者提示即使在未发炎的肝细胞中，MHC I类分子可能对于细胞生存发挥重要作用，对于后者则是发现敲低硫酸乙酰肝素生物合成酶NDST1会以细胞自主方式损害肝细胞增殖，但具体机制并未在这篇研究中探索。

总之，这项工作将“实验易处理性”和“活体研究”相结合，实现了在肝脏中基因组规模的CRISPR-Cas9筛选，这将有助于为哺乳动物生理和疾病的各个方面提供新见解。然而，能否将这项技术引入其他组织同样取决于这些组织中是否可以实现稳定、高覆盖率的sgRNA递送。这将需要开发将慢病毒有效递送至肝脏以外器官的方法，并在细胞较少的器官中实现基因组规模的覆盖。

https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100217

制版人：十一

参考文献

1. Wang, G., Chow, R.D., Ye, L., Guzman, C.D., Dai, X., Dong, M.B., Zhang, F., Sharp, P.A., Platt, R.J., and Chen, S. (2018). Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAVCRISPR–mediated direct in vivo screening.Sci. Adv.4, eaao5508. https://doi.org/10.1126/sciadv.aao5508.

2. Chen, X., and Calvisi, D.F. (2014). Hydrodynamic transfection for generation of novel mouse models for liver cancer research.Am. J. Pathol.184, 912–923. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.12.002.

3. Xu, C., Qi, X., Du, X., Zou, H., Gao, F., Feng, T., Lu, H., Li, S., An, X., Zhang, L., et al. (2017). piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice.Proc. Natl. Acad. Sci. USA114, 722–727. https://doi.org/10.1073/pnas.1615735114.