天津大学王泽方教授团队《自然·通讯》：工程化酵母全细胞催化系统实现高结晶PET塑料高效降解

聚对苯二甲酸乙二醇酯 (Polyethylene terephthalate，PET) 是一种在服装、包装、医药等领域广泛应用的塑料。然而PET产品因其极强的化学、物理稳定性，使得它至少数百年才能在自然界中自发降解，这对全球生态安全和人类健康带来了巨大威胁，那这些废弃的PET应该怎么回收处理呢？传统的物理、化学方法已经被广泛应用于工业生产，近几年“吃PET”的酶的相关研究为PET降解开拓了一种绿色道路，它能将PET分解为可重新利用的工业原料，而且同时具备传统物理法工艺简单和化学法闭环降解等优点。但是目前利用“吃PET”的酶催化降解低结晶度的PET虽然已经取得了长足进展，有些催化酶的应用甚至已经到达半工业化水平，然而对于高结晶度的PET（用来制作可乐瓶、矿泉水瓶等食品级容器），一直是这些降解酶“消化系统”的短板，降解能力十分有限。

近日，天津大学生命科学学院王泽方教授团队将吸附模块HFBI及降解模块PETase共展示在酵母细胞表面，构建全细胞催化系统，创新性地在酵母细胞表面实现了吸附和降解这两个步骤的有机统一，在疏水性的PET界面充分发挥降解酶PETase“消化系统”对高结晶度PET的消化功能，以实现对hcPET的高效降解。相关工作以《Biodegradation of Highly Crystallized Poly(ethylene terephthalate) Through Cell Surface Codisplay of Bacterial PETase and Hydrophobin》为题，于2022年11月21日发表在 Nature Communications 上。此研究是该课题组近两年内在生态安全领域（PNAS, 2021, 33876762; PNAS, 2021, 34620712；Nature Communications, 2022, 35338130）的又一重要进展。

酵母全细胞生物催化系统的构建

王泽方教授团队构建的酵母全细胞催化系统同时在酵母细胞表面展示疏水蛋白HFBI和PET水解酶PETase，模拟PET降解的两步过程，即吸附和水解，弥补现有研究对二者割裂以及主要集中在水解步骤的局限。从HFBI部分衍生出来的功能是自我组装的能力，促进酵母细胞结合到疏水性hcPET的表面；从PETase部分衍生出来的功能是降解高结晶底物PET的能力，促进hcPET的高效水解。具体实验中，研究人员将人工设计的吸附模块疏水蛋白HFBI和降解模块PETase通过表面共展示技术固定到了毕赤酵母的细胞表面，并通过优化，实现了二者在酵母细胞表面的最佳组合（图1）。

图1. 酵母全细胞生物催化系统。（a）吸附模块疏水蛋白HFBI和降解模块PETase结构图；（b）共展示系统示意图；（c）HFBI和PETase通过表面共展示技术固定到毕赤酵母细胞表面在100 ns的分子动力学模拟示意图；（d）不同诱导时间下展示在酵母细胞表面的HFBI和PETase免疫荧光图。

疏水蛋白HFBI通过增加酵母细胞表面疏水性

增加共展示细胞在PET表面的吸附

通过Western blot和荧光共聚焦成像验证吸附模块疏水蛋白HFBI和降解模块PETase成功展示在酵母细胞表面后，作者首先利用微生物对碳氢化合物的粘附（MATH）实验（图2a-2c），证明酵母细胞表面展示的HFBI是酵母细胞表面疏水性增加的原因；随后，利用接触角（WCA）实验（图2d-2e），进一步证明HFBI确实可以增加共展示细胞表面的疏水性；最后，为了确认细胞表面展示的HFBI对细胞表面疏水性的影响是否可以转化为对酵母细胞在PET表面附着的影响，作者观察了在不同条件下共展示细胞在hcPET表面的吸附，发现共展示细胞几乎覆盖了hcPET的所有表面区域，而单展示PETase的对照样品在相同的条件下在hcPET表面的吸附急剧减少（图2f）。当使用低浓度的相同的细胞进行结合测定时，也同样发现类似的吸附差异（图2g）。这些结果均说明吸附单元HFBI通过增加酵母细胞表面疏水性增加共展示细胞在PET表面的吸附。

图2. 检测共展示细胞表面疏水性。（a）MATH实验示意图；（b-c）诱导不同时间的共展示细胞MATH实验结果；（d-e）接触角实验测量结果；（f-g）不同条件下共展示细胞及对照样品在hcPET表面的吸附。

酵母全细胞生物催化系统具有高效降解活性

作者随后将构建的酵母全细胞生物催化系统用于PET塑料降解。首先探索了共展示细胞水解hcPET的最佳条件，并与纯化的PETase进行了比较。结果表明，温度、pH、蛋白浓度（图3a-c）均对共展示细胞及PETase的转化率有明显的影响，且在每种测试条件下，共展示细胞的酶活性均高于野生型PETase。最终测活结果显示，全细胞生物催化剂对hcPET（结晶度为45%）的转化率比野生型PETase提高约328.8倍（图3d）。然后，作者用扫描电镜和光学显微镜观察了共展示细胞处理的hcPET的形态变化，使用PETase处理过的hcPET作为对照。如图3e所示，在PETase处理的hcPET上几乎没有表面侵蚀，而共展示细胞处理后hcPET表面有明显的裂纹和侵蚀。同时，该全细胞催化系统也表现出了较高的稳定性，在10天长时间反应条件下，与野生型PETase对hcPET转化率0.003%相比，该全细胞催化剂将hcPET的转化率提高到约10.9%（图3f）。以上结果说明作者构建的酵母全细胞生物催化系统能够稳定、高效的降解hcPET。

图 3. 酵母全细胞生物催化系统能够高效降解hcPET。（a）温度；（b）pH；（c）蛋白质浓度对PET水解的影响；（d）最佳反应条件下共展示细胞和野生型PETase以PET为底物的转化率；（e）商用hcPET薄膜与PETase和共展示细胞孵育前后的SEM图像；（f）最佳反应条件下共展示细胞、单展示PETase细胞及野生型PETase长时间降解hcPET相对降解率。

酵母全细胞生物催化系统具有稳定降解活性

为了测试该共展示细胞能否用于工业规模的全细胞生物催化剂，作者评估了与共展示细胞工业应用相关的几个特性，包括热稳定性、可重用性、化学或溶剂稳定性、存储条件。从图4a可以看出，在30°C下孵育7天，共展示细胞的相对转化率保持在100%，说明在这段孵育时间内，酶活性几乎没有变化，而且回收7轮之后仍能保持50%酶活（图4b）。图4c显示，当共展示细胞在含有0.1% Triton X-100、10% 甲醇、10% 乙醇中培养时，仍能保持较高酶活。冻干是一种有利于共展示细胞储存和运输的脱水过程，从图4d可以看出，冷冻干燥后共展示细胞对PET的转化率仍然接近100%，说明全细胞生物催化剂在脱水后几乎保留了全部的酶活性。综上所述，构建的酵母全细胞生物催化系统降解hcPET具有稳定性。

图4. 酵母全细胞生物催化系统降解hcPET具有稳定性。（a）热稳定性；（b）循环使用性； （ c）化学试剂对共展示系统的影响；（d）冻干对共展示系统的影响。

酵母全细胞生物催化系统降解hcPET的分子机制

随后，作者对该全细胞生物催化系统降解hcPET进行了分子动力学模拟，提出共展示系统通过两步降解hcPET的分子机制。首先，由于吸附模块HFBI的存在，共展示细胞迅速吸附到hcPET表面，且在hcPET上的吸附率接近100%。随后，降解模块PETase接触高结晶度PET的表面，并以顺式构象水解PET链，从而实现高结晶度PET的高效水解（图5）。说明粘附模块的引入是该系统高效降解hcPET的关键。

图5. 全细胞催化系统水解hcPET示意图。

此项研究提供了一种高效生物降解hcPET的策略，证明了表面展示系统的可塑性，通过在表面展示系统中引入不同的功能模块，可以大大提高其性能，对开发其它高性能协同表面展示系统具有重要的借鉴意义。

文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-34908-z

来源：课题组供稿

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