中科院1区-广州中医药大学揭示大黄素通过PPARγ靶向结肠代谢抑制兼性厌氧菌缓解溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(UC)是一种以结肠或直肠炎症复发为特征的常见疾病，在世界范围内发病率不断上升。多项研究表明，UC患者结肠中PPARγ mRNA和蛋白的表达水平降低。除此之外，有研究表明，在PPARγ缺陷小鼠结肠上皮中，一氧化氮合酶2 (NOS2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达明显增加，导致结肠黏膜中硝酸盐水平显著升高，从而引起肠杆菌科的快速异常增殖，抑制益生菌的生长，导致肠道菌群失调。大黄素是中药大黄、虎杖的活性成分，具有抗炎和肠黏膜保护作用。在前期研究中，已经发现大黄素对右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎有明显的缓解作用。因此在本研究中，作者对大黄素治疗溃疡性结肠炎(UC)的潜在机制进行了探索。

首先，作者用3% DSS诱导溃疡性结肠炎模型。与对照组相比，模型组小鼠体重在第5天后显著下降，大黄素减轻了小鼠体重下降，且呈剂量依赖性。然而，大黄素联合PPARγ抑制剂GW9662对减重效果无显著影响。除此之外，美沙拉嗪、罗格列酮和大黄素对UC小鼠结肠形态和长度均有显著改善作用，溃疡和炎症细胞浸润明显减少，且大黄素效果更明显，但是大黄素联合GW9662组小鼠结肠病理状态与模型组相似，结肠形态和长度均没有改善。上述证实了大黄素对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用取决于PPARγ。

然后，作者研究了大黄素对UC小鼠PPARγ信号通路的调控。在UC小鼠结肠组织中，PPARγ蛋白表达显著降低，iNOS和NF-kB p65蛋白表达显著升高，中性粒细胞浸润升高。在使用大黄素后，PPARγ的表达显著恢复，iNOS和NF-kB p65的表达被抑制，中性粒细胞浸润降低。而大黄素与GW9662联合使用则无此效果。除此之外，UC小鼠血清细胞因子IFNγ、IL-22、TNF-α和CXCL8水平显著升高，TGF-β细胞因子水平显著降低。大黄素治疗后，血清中IFNγ、IL-22、TNF-α、CXCL8水平显著降低，TGF-β水平显著升高。而大黄素与GW9662联合使用后，血清细胞因子IFNγ、IL-22具有显著性差异，而TNF-α、CXCL8和TGF-β不具有显著性差异。综上可得，大黄素对UC小鼠血清细胞因子IFNγ和IL-22的影响与PPARγ有关。

接下来，作者建立了IFNγ和IL-22诱导的Caco-2细胞炎症模型，研究大黄素对Caco-2细胞PPARγ蛋白和基因表达的影响。结果表明，大黄素可直接提高Caco-2细胞中PPARγ蛋白和基因的表达，而大黄酸无明显影响。说明大黄素直接调节PPARγ信号通路，而不是通过其代谢产物大黄酸。此外，大黄素还能明显降低IFNγ和IL-22刺激培养的Caco-2细胞上清液中IL-8的水平。

然后，为了提供大黄素，PPARγ和炎症之间关系的直接证据，作者用转染法来沉默Caco-2细胞中的PPARγ基因，用RT-PCR、Western Blot和IC-IF等方法选出转染最佳的shPPARγ-Caco-2-2细胞。与对照组相比，IFNγ和IL-22刺激Caco-2-NC、Caco-2-sc和shPPARγ-Caco-2细胞iNOS蛋白表达明显升高。与模型组比较，大黄素给药后Caco-2-NC细胞和Caco-2-SC细胞iNOS蛋白表达明显降低，但是大黄素对shPPARγ-Caco-2细胞iNOS蛋白表达无抑制作用，进一步证实大黄素的作用靶点为PPARγ。此外，作者还评估了PPARγ和大黄素的结合亲和力，发现了大黄素与PPARγ之间的潜在结合位点。大黄素与PPARγ的ARG 288、CYS 285形成氢键，发挥生物活性。

接下来，作者探索了大黄素调节PPARγ改善小鼠结肠细胞代谢，通过HPLC-MS对小鼠结肠代谢物进行分析。与对照组相比，UC小鼠发生了明显的代谢变化，大黄素促进代谢物恢复到类似对照组的水平。其中，对照组与模型组差异表达的代谢物有110个，其中95个上调，15个下调。模型组与大黄素组差异表达的代谢物有47个，其中22个上调，25个下调。差异代谢物的KEGG途径富集分析显示，大黄素对类固醇激素生物合成、氧化磷酸化、甘油磷脂代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢、AMPK信号通路、花生四烯酸代谢、胆汁分泌均有调节作用。

最后，作者探讨了大黄素对于UC小鼠肠道菌群的平衡作用。利用16S rDNA测序分析小鼠肠道菌群的变化，与对照组相比，DSS明显降低了样品的多样性程度，大黄素有助于物种丰富度的恢复。采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，模型组大鼠肠道菌群组成与其他各组差异显著，大黄素、美沙拉嗪、罗格列酮与对照组相似。此外，还比较了正常组、模型组、大黄素处理后在门、纲、科、属、种等水平上的菌群的差异。

综上所述，大黄素治疗溃疡性结肠炎的机制依赖于其调节PPARγ信号通路，调节结肠代谢，恢复肠道稳态。

DOI: 10.1016/j.phymed.2022.154106

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