Science Advances | 刘长军课题组揭示植物调控P450活性的新机制

细胞色素P450是一类以血红素 （heme） 为辅基的庞大酶超家族，广泛参与包括脂肪酸、植物固醇、植物激素和苯丙素类等代谢物的生物合成。植物苯丙素类-木质素单体合成途径形成众多的酚类化合物，并为细胞壁木质素提供前体。此途径中的三个P450酶，C4H，C3’H和F5H1催化了羟基肉桂酸类化合物的形成，决定了植物中游离酚的不同种类以及细胞壁木质素的三种结构类型， 即H-， G-和S-型木质素。作为直接行使单加氧反应的末端酶，P450的功能得到广泛研究，然而其电子传递系统 （成员包括CPR，CBR和CB5） 在植物代谢物合成中的功能鲜有关注。

内质网上有两类还原酶，CPR和CBR，可以分别利用NADPH和NADH来传递还原力，二者皆可以还原细胞色素B5 （CB5） 蛋白，长期以来CPR被认为是P450的主要电子供体。美国能源部布鲁克海文国家实验室刘长军实验室前期研究发现，拟南芥的CB5 家族成员CB5D是P450 酶F5H1不可或缺的电子供体 （Plant cell, 2019） 。CB5D可同时接受CPR和CBR传递的电子，这些电子传递蛋白在促进F5H1功能时的具体分工机制是怎样的？在苯丙素类-木质素单体合成途径中的另外两个P450，C3’H和C4H的功能发挥是否也需要CB5D的协助？

近日，美国能源部布鲁克海文国家实验室刘长军课题组在Science Advances发表了题为Tissue-preferential recruitment of electron transfer chains for cytochrome P450-catalyzed phenolic biosynthesis的研究论文。该研究发现不但不同的P450酶利用不同的电子传递链获取还原力，同一P450酶在拟南芥的不同组织部位中可以招募不同的电子传递链为其提供还原力，进而调节次生产物的合成。

在本研究中，作者发现，1）拟南芥苯丙素类-木质素单体合成途径中的P450从不同的电子传递链获取还原力，植物进化早期形成的C4H利用了经典的NADPH-CPR途径，而进化后期形成的F5H1可以同时从NADPH-CPR-CB5和NADH-CBR-CB5两种途径获得还原力；而且2）在不同的植物组织中，F5H1从不同的电子传递链获取还原力形成不同的酚类物质。在茎中，F5H1主要以NADPH-CPR-CB5途径获取还原力促进S-型木质素的形成， 而在种子中，F5H1主要从NADH-CBR-CB5途径获取还原力合成种子中游离的、以及与种皮木栓质结合的芥子酸脂；3）造成电子传递在不同组织中分化利用的原因可能取决于NADH和NADPH在植物不同组织中的含量、电子传递链成员在不同组织中的表达水平、以及CPR和CBR还原酶对CB5进行还原的效率差异，这三种因素综合调控了F5H1催化的反应。

拟南芥的CB5家族有5个成员，其中4个定位于内质网，为了确定内质网定位的CB5的潜在功能冗余性，作者创制了内质网定位的CB5基因四突变体，这个四突变体中的S-型木质素并没有在CB5D单基因突变体的基础上进一步显著降低，而且其它三个CB5并不能互补CB5D基因单突变体缺陷，说明CB5D是为F5H1提供还原力的最主要成员。同时观察到四突变体中的G-型木质素含量不但没有降低，反而略有增加，说明控制G-型木质素前体的P450酶C4H和C3’H功能并不受CB5的调节。在酵母中进行蛋白质互作研究发现，CB5D与拟南芥的CBR和CPR都可以互作，进一步通过对原核表达纯化的电子传递蛋白进行体外测试发现，拟南芥的CBR和CPR都可以有效地还原CB5D，但CBR对CB5D的还原效率显著高于CPR。但是，CPR基因突变体，而非CBR基因突变体显著影响了茎中S-型木质素的含量。进一步分析发现，种子中游离的以及与种皮木栓质结合的芥子酸脂含量在CBR基因突变体中明显降低，而在CPR基因突变体中则只有略微降低。这说明在不同的组织部位中，CBR和CPR为F5H1提供电子的能力不同。作者进一步分析了造成这一现象的原因、发现CPR和CBR在不同组织部位中的基因表达水平、CPR和CBR对CB5进行还原的不同效率、以及NADH和NADPH在不同组织中的积累水平综合影响P450酶对对电子传递链的选择。最后，利用合成生成学的手段，作者在酵母中重构了C4H和F5H1的电子传递系统，为了减小不同实验组中外源蛋白表达量的差异，C4H和F5H1 P450基因以及电子传递成员经由2A片段连接构建在同一载体中共表达。通过酵母菌饲喂实验以及微囊体活性测试，作者确认了C4H主要接收NADPH-CPR传递的电子，而F5H1则可以同时利用NADH-CBR-CB5和NADPH-CPR-CB5传递的还原力 （该方法以Book Chapter形式发表于Methods in Enzymology一书） 。

综上，本研究发现了植物调控酚类化合物形成的P450酶活性的另一层分子机制， 即电子传递系统。对P450—电子传递链互作的研究有助于进一步了解P450系统是如何运作的，这将使我们可以根据P450对电子传递链的偏好性创造出更有效的酶系统，从而加强有机碳源的转换和储存，并定向获得所需的生物制品，提高投入产出比。

图1. 拟南芥C4H和F5H1利用不同的电子传递链获取电子。

该论文的通讯作者为刘长军（Chang-Jun Liu） 研究员，第一作者为赵先海（Xianhai Zhao） 博士。刘长军课题组早期成员赵运军（Yunjun Zhao） 博士和苟明月（Mingyue Gou） 博士为共同作者。

参考文献：

Zhao X, Zhao Y, Gou M, Liu CJ. Tissue-preferential recruitment of electron transfer chains for cytochrome P450-catalyzed phenolic biosynthesis. Science Advances. 2023 Jan, doi/10.1126/sciadv.ade4389.

Zhao X, Liu CJ. Biocatalytic system for comparatively assessing the functional association of monolignol cytochrome P450 monooxygenases with their redox partners. Methods in Enzymology (Academic Press). 2022; 676:133-158.

Gou M, Yang X, Zhao Y, Ran X, Song Y, Liu CJ. Cytochromeb5 Is an Obligate Electron Shuttle Protein for Syringyl Lignin Biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 2019 Jun;31(6):1344-1366.

论文链接：

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.ade4389