发现ERR是心室心肌细胞命运决定的重要转录因子

细胞命运的决定与维持是一个精细的生物学调控过程，其包括细胞特异性转录因子的转录表达，细胞特异性的增强子等基因组调控元件的激活，进而调控细胞特异性的基因表达。这其中伴随着组蛋白修饰，染色质可及性，基因组三维结构等一系列染色质多维度的调控发生。

心房心肌细胞和心室心肌细胞是形态功能差异巨大的两类心肌细胞。细胞特化的差异对于维持心脏功能至关重要。然而对于调控这两类细胞特异性基因表达谱的表观遗传及三维基因组信息仍然知之甚少。这限制了我们更加深入的了解心脏发育过程和先天性心脏病的发生发展。

近日，哈佛医学院William T. Pu教授团队在Circulation上发表了题为In vivo dissection of chamber selective enhancers reveals estrogen-related receptor as a regulator of ventricular cardiomyocyte identity的文章。

该研究通过蛋白乙酰化转移酶P300及心脏7个重要转录因子的bioChIP-seq, RNA-seq, MPRA, ATAC-seq, H3K27ac HiChiP-seq等一系列前沿的技术方法绘制了心房和心室心肌细胞多维度的染色质图谱，鉴定了1092个有心脏功能活性的增强子，229个腔室特异性的增强子及一系列调控腔室特异性增强子的转录因子。结合雌激素相关受体α和γ（ERRα/γ）双敲小鼠，发现ERR是心室心肌细胞命运决定的重要转录因子。

P300及多个转录因子结合位点MTF（大于四个转录因子同时结合的DNA区域）被报道可以预测细胞特异性的增强子。作者首先构建了P300及心脏7个重要转录因子 ( GATA4, MEF2A, MEF2C, NKX2-5, SRF, TBX5, TEAD1) 的flag-bio敲入小鼠。表达于Rosa26位点的BirA特异性的识别并生物素标记BIO，进一步通过链霉素亲和素包被的磁珠pull down与BIO融合的P300或转录因子，进而可得到其结合的DNA。通过高特异性的bioChIP-seq，作者绘制了P300及7个TFs心房心室全基因组的结合图谱，鉴定了12551个P300, 8612个MTF腔室特异性的结合位点。

为了在体验证这些P300及MTF腔室特异性结合位点的活性及腔室特异性，作者开发了腺相关病毒AAV9依赖的大规模平行报告基因筛选技术（AAV9-MPRA: AAV9 based massively parallel reporter assay）。通过将3897个候选者克隆在报告载体的3’UTR区（增强子在此位置可以驱动调控自身转录），结合扩增子测序，作者鉴定了1092个在心脏中有功能活性的增强子，110个心房特异性的增强子和119个心室特异性的增强子。进一步通过整合11387个心脏疾病GWAS相关的SNP位点，作者鉴定了一系列与房颤、心衰和心梗相关的心脏增强子。

增强子通常位于开放的染色质区域，作者猜想染色质可及性可能参与调控不同腔室增强子的活性及特异性。通过ATAC-seq发现，腔室特异性增强子区域的染色质可及性在两类心肌细胞差异巨大。在其有活性的细胞中，染色质开放性显著高于无活性的细胞。为了构建增强子与其靶基因的调控网络，作者通过H3K27ac HiChIP三维基因组技术，将MPRA鉴定的腔室特异性增强子与靶基因相连，结合转录组分析发现，腔室特异性增强子的靶基因在其对应的腔室中转录活性显著高于另一腔室，且通过腔室特异性染色质环相连的靶基因，转录活性更具腔室特异性。这提示3D基因组介导的增强子-靶基因互作，共同调控腔室特异性的基因表达。

增强子通过招募细胞特异性的转录因子进而调控细胞特异性的基因转录。为了筛选调控腔室特异性增强子的转录因子，作者设计了5bp分辨率连续突变的MPRA文库。通过高分辨率的突变库结合非冗余的心脏特异性的转录因子文库，作者鉴定了一系列调控腔室特异性增强子的转录因子。其中大量心室特异性增强子丢失ERR motif后，导致其失去心室增强子活性及特异性。结合ERRα/γ心肌特异性敲除小鼠，作者发现ERR缺失的心室心肌细胞中大量心房特异性基因表达显著上调，同时大量心室特异性基因表达下降，造成心室心肌细胞心房化。

总而言之，作者结合转录组，多维度的表观遗传组，3D基因组等多组学的手段构建了心脏腔室特异性的染色质图谱；GWAS相关的增强子鉴定为心肌疾病的诊断和治疗提供新的线索；基于大规模平行报告基因鉴定的腔室特异性增强子库为腔室特异性基因递送系统的开发提供了有力的工具。

哈佛大学附属波士顿儿童医院心血管研究中心曹阳坡，张晓然，Brynn Akerberg为本文第一作者，该研究中心主任Willam T. Pu博士为本文通讯作者。该研究同时得到了宾夕法尼亚大学心血管研究所Daniel P. Kelly课题组的大力支持。

https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCULATIONAHA.122.061955

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