连佳长丨首次利用毕赤酵母从头合成长春碱前体，构建复杂合成途径

1958 年，著名的抗癌药物长春碱（vinblastine）问世，此后极大地影响了全球数百万癌症患者的生活和治疗。时至今日，长春碱仍然活跃在临床前线，与其它强效药物联合使用，用于治疗霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌和其他形式的癌症，也是多种癌症最有效的疗法之一。

虽然长春碱自问世第二年就迈入了商业化进程，可几十年过去，它的生产方式却一直没有太大的进步。

工业上生产长春碱是先从长春花中提取和纯化得到前体 “文多灵”（vindoline） 和 “长春质碱”（catharanthine），再将此二者通过简单的体外化学偶联和还原以形成长春碱。这种方式产率极低，一般来说，500 公斤的长春花干叶仅能获得 1 g 长春碱。必然地，市场上呈现出供需失衡的局面。

▲图丨长春花（来源：Max Planck Institute）

2000 年左右，合成生物学的兴起让科学家们看到了破局的希望，那就是将长春碱的生物合成途径进行异源重组，利用“细胞工厂”进行生产。然而，在长春花中，长春碱合成的化学机制相当复杂，其生物合成基因的鉴定一直难以完成。

直到 2018 年，Sarah O'Connor 等人在 Science 发文，确定了长春碱生物合成中最后几个未知基因，打通了长春碱完整合成路径。这也意味着研究人员将能够通过合成生物学技术生产长春碱。

▲图丨连佳长（来源：受访者提供）

文章一经发布，美国工程院院士 Jay D. Keasling 带领的团队，以及浙江大学连佳长带领的团队都迅速投入到长春碱的异源合成工作中。

近期，Jay D. Keasling 团队和连佳长团队相继公布研究成果，分别实现首次在模式生物酿酒酵母和非模式生物毕赤酵母中从头合成长春碱前体。连佳长团队的研究成果于 2023 年 1 月 9 日在 Nature Synthesis 上发表，文章题为 “Biosynthesis of Catharanthine in Engineered Pichia pastoris”。

（来源：Nature Synthesis）

“这是目前为止在非模式生物中异源合成的最复杂的分子，我们的研究将巴斯德毕赤酵母确立为一个细胞工厂，用于生产具有复杂生物合成途径的植物天然产物。”连佳长说道。

接连突破，首次在毕赤酵母中从头合成长春碱前体

众所周知，较之模式生物（如酿酒酵母），非模式生物（如毕赤酵母）的基因编辑和代谢调控都要更加困难。在 Keasling 之前，尚且从未在模式生物中构建如此长的合成途径，在非模式生物中构建的难度只会更高。

连佳长团队的研究也有一个“由简入难”的过程，他们首先实现了在模式生物酿酒酵母中生产长春碱的前体——长春质碱和文多灵。

Jay D. Keasling 团队的文章在线发表时，连佳长团队的手稿也已经在审查中，并于 2022 年 12 月 26 日在 BioDesign Research 上发表。在这项研究中，实验室摇瓶发酵的长春质碱和文多灵的产量分别为 527.1 μg/L 和 305.1 μg/L。

谈及与 Keasling 团队研究的异同之处，连佳长告诉生辉 SynBio，“两篇文章所用的长春碱生物合成途径和基因编辑方法基本相同；发酵条件不是完全一致，比如 Keasling 团队用的是合成培养基，而我们用的是营养更加丰富的复杂培养基；另外，团队做了更多关于辅因子（如 NADPH、SAM 以及 CYP 电子传递）供应强化的工程改造，对于提高途径中 P450 酶、甲基转移酶、氧化还原酶等关键酶的催化性能具有重要作用。”

在这项研究的基础上，连佳长团队在毕赤酵母中的工作也开展得更加顺利。

据他介绍，两篇文章所用的合成途径是完全一样的，且均采用模块化思路，将复杂的生物合成途径分为上游、中游、下游 3 个功能模块，分别进行构建和优化。

（来源：受访者提供）

“主要差异在于模块的构建顺序：酿酒酵母基因操作简单，且上游途径有较多的前期研究，因而我们主要采用从上至下的构建顺序，也就是先构建和优化异胡豆苷底盘细胞，然后进一步引入长春质碱和文多灵的生物合成模块，进而实现长春碱前体的从头生物合成；”

“另一方面，毕赤酵母的基因操作则较为麻烦，且前期没有该途径相关的研究基础，我们采用由下而上的逆向构建思路，也就是通过添加途径中间体（如异胡豆苷）先构建和优化下游的长春质碱功能模块，然后进一步引入上游合成途径直至实现从简单碳源到长春质碱的从头生物合成。”

▲图丨在毕赤酵母中分模块构建及优化长春质碱从头合成途径（来源：Nature Synthesis）

最终，利用分批补料发酵，团队构建的毕赤酵母工程菌株 CAN19 在摇瓶和发酵罐上的长春质碱产量分别为 0.38 mg/L 和 2.57 mg/L。

持续优化，看好非模式生物的生产潜力

在非模式生物中创建如此复杂的生物合成途径，主要难点在于基因编辑效率较低以及前期相关的研究基础较少。“研究基础少意味着要进行大量的实验测试，但基因编辑效率低下会使得研究周期大大延长。”

在这项研究中，连佳长等人通过选择稳定的整合位点、筛选活性和/或特异性更高的途径酶、增加限速酶的基因拷贝数、重构细胞代谢以及优化发酵工艺，创建了能够高效合成长春质碱的毕赤酵母细胞工厂。

▲图丨基于 CRISPR/Cas9 系统的毕赤酵母基因组编辑技术体系（来源：受访者提供）

他表示，接下来团队将会持续改进毕赤酵母的基因编辑技术体系；此外，将结合基因挖掘、蛋白质工程、途径工程、多细胞体系等技术手段进一步提高长春碱前体的合成水平。”

“虽然离实际应用还有比较大的距离，工程改造的难度也很大，但我们会一直坚持下去，希望将来的某一天能够实现我们的小目标。”

此外，连佳长还表示看好非模式生物的发展潜力，一方面，非模式微生物在特定应用场合有其独特的优势，比如甲基营养型酵母用于外源蛋白高效表达以及甲醇高效生物转化、产油酵母用于合成脂肪酸衍生物、耐酸酵母用于高效生产有机酸等；

另一方面，本项工作实现了甲醇到长春碱前体的直接转化，说明通过合成生物学改造，毕赤酵母具备将甲醇转化为高附加值化合物的潜力。

他说：“希望将来我们能够像编辑模式微生物一样来编辑非模式微生物，但是，从合成生物学领域来看，是将模式微生物改造成更加通用、性能更好的底盘细胞，还是根据应用场景选择特定的非模式微生物并加以改造，还将持续争论一段时间。”

专注技术开发，多个产品具备产业化应用前景

连佳长在浙江大学获得本科（2007）和硕士（2010）学位，之后前往美国伊利诺伊大学香槟分校（UIUC）深造，师从赵惠民教授，开展合成生物学与代谢工程研究，并于 2015 年获得博士学位。博士毕业之后，他继续在 UIUC 开展基因组编辑技术的博士后研究；2017 年全职回国加入浙江大学化学工程与生物工程学院，组建合成生物学细胞工厂研究团队。

（来源：受访者提供）

目前他的主要研究方向是基于基因组编辑技术和合成生物学原理的微生物细胞工厂创建，具体包括：1）基于基因组编辑技术的合成生物学方法开发；2）合成植物天然产物等高附加产品的微生物细胞工厂开发；3）碳一化合物高效生物转化的微生物细胞工厂开发。

除了长春碱之外，连佳长课题组也创建能够高效合成其他植物天然产物、功能化学品等高附加值化合物的微生物细胞工厂，包括血根碱、檀香烯、荆芥醇、腺苷甲硫氨酸、生物素等。

据他介绍，团队多个产品的产量为文献报道的最高水平，具备一定的产业化应用前景。

“目前课题组工作以技术开发为主，有一些与企业共同技术开发的项目，但还没详细考虑过商业化计划。如果后续有合适的契机，尤其是合作者，再开始考虑产业化的相关事宜。”