巨噬细胞与CSF-1/CSF-1R通路相关知识

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前言

肿瘤微环境 (TME) 通过趋化因子的分泌或与基质细胞的直接相互作用，在促进肿瘤细胞运动和侵袭的这些步骤中起着至关重要的作用。作为一个由多个细胞和非细胞成分协调的动态系统，TME的每个细胞成分都代表了重新编程 TME 的潜在目标。肿瘤相关的肝脏微环境由肝细胞、库普弗细胞 (KC)、肝窦内皮细胞、肝星状细胞 (HSC) 和招募的免疫细胞组成，如 T 细胞、NK 细胞、骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)等。图1总结了多种抗肿瘤中药及其成分调节的先天和适应性免疫细胞。

图1. 抗癌免疫图解总结：多种抗肿瘤中药及其成分调控的先天性和适应性免疫细胞[2]。免疫细胞：M.巨噬细胞；NK.自然杀伤细胞；DC.树突状细胞；MDSC.髓系抑制性细胞。中药及其成分：A.红景天；B.黄芪；C.黄芪甙Ⅳ；D.草头凌霄提取物；E.大豆皂苷；F.黄芪多糖；G.党参多糖；H.丹参酮；I.牛膝多糖；J.冬虫夏草；K.蝎子醇；L.胡椒提取的一种糖蛋白；U.灵芝多糖；V.丹参多糖；N.抗癌一号，一种中药配方；O.紫锥菊；P.四甲基吡唑磷酸盐；Q.人参皂苷；R.HemoHIM，由三种中药制成的草药制剂（广藿香，当归，芍药）；S.甘草多糖；T.补肾固本方；W.淫羊藿苷；X.天门冬多糖；Y.马钱子碱；Z.藤黄酸；PV.紫花地丁。红色箭头表示激活，蓝色直线表示抑制，红色或蓝色圆点内的字母表示传统中药或其成分.

巨噬细胞的异质性分型

巨噬细胞是一类参与对抗外来入侵，具有吞噬功能，其次有传递抗原能力的一类免疫细胞，相对于树突细胞，巨噬细胞不具备移动能力，而树突细胞可以结合抗原并将抗体运往淋巴细胞。巨噬细胞起源于单核细胞，单核细胞通常可分化为促炎M1巨噬细胞（经典激活），但在某些情况下，如在许多肿瘤微环境中，它们可以分化为抗炎M2巨噬细胞（交替激活）。M1巨噬细胞通常被认为是抗癌的，介导Th1型免疫应答，分泌ROS、iNOS、RNS、TNF-α、IL-1、IL-12、IL-23促进炎症，发挥宿主免疫反应杀伤肿瘤；但也会导致正常组织的炎症损伤。相对于M1，M2巨噬细胞被认为是促癌的，介导Th2型免疫反应参与免疫调控（如免疫抑制因子IL-10），参与基质沉积（黏附）和组织修复。M1和M2可以因为条件转变而互相转换，因此将M2极化向M1极化方向改变被认为是一种抗癌思路。在微环境中，肿瘤为了逃避巨噬细胞的杀伤作用而迫使其活化表型和功能从经典的M1型朝着有利于肿瘤发展的M2型转化。因此，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）既有M1和M2的表达模式，也有与M1和M2巨噬细胞不同的表达模式。在大多数已建立的肿瘤中，TAMs具有M2巨噬细胞的大多数代表性特性。初级TAMs可以通过分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趋化因子招募单核细胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下发生极化，具有类似于M2型巨噬细胞的表型，并分泌多种细胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趋化因子（招募Th2和调节性T细胞），介导免疫抑制效应；分泌多种细胞因子、生长因子（如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基质金属蛋白酶（MMPs）、M-CSF等分子，促进慢性炎症、血管新生、肿瘤侵袭和调节免疫反应，从而促进肿瘤进程。近年来，又发现了多个巨噬细胞类型：CD169+巨噬细胞; TCR+巨噬细胞。

巨噬细胞的激活和标记物

巨噬细胞活化的多样性和不一致的使用标记在一定程度上阻碍了研究。人外周血单核细胞系THP-1是常用的诱导巨噬细胞材料。佛波酯（PMA）+IL-4/IL-13可用于诱导M2巨噬细胞，LPS+IFN-γ用于诱导M1巨噬细胞。IL-4诱导的巨噬细胞可细分为M2a亚型，主要诱导Th2型免疫反应，在过敏性反应和寄生虫感染免疫中起主要作用。M2a 巨噬细胞，也称为伤口愈合巨噬细胞，表达高水平的甘露糖受体（MR，也称为 CD206）、诱饵 IL-1 受体（IL-R）和 CCL17，它们分泌促纤维化因子，如 TGF-β、胰岛素样生长因子 (IGF) 和纤连蛋白，以促进组织修复。低浸润是以T细胞为基础的抗癌治疗的主要障碍，而在肿瘤微环境中，巨噬细胞占据了浸润免疫细胞的30-50%。循环中的单核细胞是肿瘤中浸润巨噬细胞的主要来源，而外周血单核细胞的可获得性使临床上采用以巨噬细胞为基础的治疗策略变得更容易操作。巨噬细胞靶向策略：抑制巨噬细胞募集，巨噬细胞存活率下降，抑制促肿瘤功能，解除巨噬细胞上的blockade，表型极化的诱导，效应细胞的修饰。

图2 活化巨噬细胞的标记系统[3]。根据刺激小鼠CSF-1巨噬细胞或人单核细胞源性CSF-1巨噬细胞的M1-M2光谱概念，显示了功能分区。刺激条件为IL-4、免疫复合物（Ic）、IL-10、具有TGFβ的糖皮质激素、单独的糖皮质激素、LPS、LPS和IFN-γ以及单独的IFN-γ。标记数据来自作者实验室的广泛已发表和未发表的数据，代表了一个开始的共识。星号表示通过深度测序对人类IL-4基因的确认。

根据活化状态、功能及分泌的细胞因子不同，巨噬细胞主要可分为M1和M2型巨噬细胞。CD68在临床上可以作为巨噬细胞的指示标志（细胞浆糖蛋白），在巨噬细胞的吞噬活动，胞内溶酶体的新陈代谢，胞外的细胞与细胞以及细胞与病原体的相互作用中发挥作用。F4/80（EMR1）多用于标记成熟小鼠巨噬细胞，在巨噬细胞的成熟和活化过程中表达变化明显，参与细胞黏附，并可能参与专门涉及免疫系统细胞的细胞间相互作用。CD206是先天免疫系统中重要的模式识别受体和内吞受体，可作为M2巨噬细胞标记物。HLA-DR (MHC-II类分子) ，CD80/CD86（互为活化T淋巴细胞时的协同刺激因子）可用于标记M1巨噬细胞，与免疫治疗密切相关。除此之外，在M2巨噬细胞中，可以检测到高水平的IL-10，TGF-β和Arg-1。在TAM中，最重要的标记物是CD68,还包括脂多糖共同受体CD14, HLA-DA和CD16。在此基础上，联用CD163,CD204或CD206可用于鉴定M2型巨噬细胞。此外，M2型巨噬细胞能大量分泌MMP1,MMP2和MMP9，故可以连用CD68/CD163鉴定M2。

巨噬细胞的靶向策略

低浸润是以T细胞为基础的抗癌治疗的主要障碍，而在肿瘤微环境中，巨噬细胞占据了浸润免疫细胞的30-50%。循环中的单核细胞是肿瘤中浸润巨噬细胞的主要来源，而外周血单核细胞的可获得性使临床上采用以巨噬细胞为基础的治疗策略变得更容易操作。巨噬细胞靶向策略：抑制巨噬细胞募集，巨噬细胞存活率下降，抑制促肿瘤功能，解除巨噬细胞上的blockade，表型极化的诱导，效应细胞的修饰。

CSF-1/CSF-1R 通路

CSF-1是集落刺激因子1，基因位于1p13断点处，以膜结合形式、分泌糖蛋白和蛋白聚糖的形式产生, 细胞表面和分泌的蛋白聚糖形式在体内平衡中具有独特的作用，并在炎症期间诱导增殖。目前，CSF-1R被认为是CSF-1的唯一受体。CSF-1R由c-fms原癌基因编码， 是内在酪氨酸特异性蛋白激酶活性的生长因子受体家族之一，被发现存在两种配体CSF-1和IL-34。IL-34和CSF-1在功能上具有相似性，但IL-34比CSF-1表达受限，且对于CSF-1R激活的作用更强。IL-34和CSF-1在人体中互补激活。

图3 CSF1R控制组织巨噬细胞密度的模型[4] CSF1R信号控制组织巨噬细胞的增殖。组织基质不断分泌CSF1，而巨噬细胞消耗CSF1，使细胞密度保持在CSF1R信号所需的增殖阈值之下。稳态死亡/迁移（B）或炎症期间的消失（C）增加了可用的CSF1，而并不一定改变CSF1的产生，从而允许增殖恢复正常密度。升高的CSF1分泌刺激细胞增殖到比正常密度更高的组织密度（D），但也可以通过巨噬细胞趋化因子的产生刺激单核细胞的招募（E）。招募很可能需要比增殖更高的CSF1R信号阈值，但这仍有待确定。其他因素，如IL-4，可以使巨噬细胞独立于CSF1增殖，从而在CSF1限制和不伴随单核细胞招募增加巨噬细胞数目（F）。缩写：CCR，趋化因子CC受体；CSF，集落刺激因子；IL，白细胞介素；MF，巨噬细胞.

CSF-1和CSF-1R 对巨噬细胞增殖，分化，存活至关重要。先前的研究指出CSF-1 通过与其受体 (CSF-1R) 结合启动促有丝分裂反应 ，从而激活受体的内在酪氨酸激酶活性并通过多种效应介导的途径启动信号传导。整个 G1 期都需要 CSF-1，以确保骨髓来源的巨噬细胞进入 S 期。除此之外，CSF-1可以通过自分泌及旁分泌影响可以表达CSF-1R的细胞的增殖，在巨噬细胞，肿瘤中均有发现。组织基质持续分泌CSF1，而巨噬细胞消耗CSF1使种群密度刚好低于CSF-1R调节增殖所需要的信号阈值。而CSF-1的趋化性可能需要高于激活CSF-1R的阈值。除此之外,如IL-4等因子可以独立于CSF-1增加巨噬细胞数量。CSF-1/CSF-1R参与巨噬细胞的极化，从而影响巨噬细胞的功能。CSF-1被认为可以促进巨噬细胞的M2极化。

CSF-1/CSF-1R通路在巨噬细胞和肿瘤细胞之间的串扰机制

CSF-1/CSF-1R通路与肿瘤进程密切相关，CSF-1和CSF-1R的高表到往往代表着预后不良。CSF-1/CSF-1R 通路涉及旁分泌和自分泌。旁分泌涉及TAMs,巨噬细胞,肿瘤细胞，可以是CSF-1/CSF-1R信号环，也可能是旁分泌 CSF-1/EGF 信号环，在不同类型和病理特征的肿瘤中，选择性发挥作用。

CSF-1/CSF-1R一方面直接作用于癌细胞。在一些高度侵袭的癌细胞中检测到高水平的CSF-1和CSF-1R。并且体外实验表明，促进肿瘤细胞过表达CSF-1或CSF-1R会促进癌细胞的增殖，迁移和侵袭。但在一项CSF-1R抑制剂的临床报告中并未体现。另有研究指出炎症性疾病是携带CSF-1R细胞自分泌调节的主要结果，这些事件可能是自分泌调节的CSF-1表达细胞发生肿瘤转化所必需的。

通过动员和调节免疫系统响应激活单核清除系统间接促进肿瘤的发展是CSF-1/CSF-1R促进肿瘤进展最重要的方面。肿瘤细胞往往过度表达CSF-1，这是一种单核细胞趋化剂，募集来源于血液循环中的单核细胞，在与CSF-1R结合后调控巨噬细胞增殖、存活和分化。在各种类型的癌症中，CSF-1的过表达与TAMs的激活和募集有关。a.CSF-1/CSF-1R 促进血管生成。与CSF-1R结合后，CSF-1促进TAMs增殖并支持它产生大量不同的促血管生成因子。b. CSF-1/CSF-1R 改变细胞微环境。CSF-1/CSF-1R 可以影响各种因子的生成和调节它们的分泌，如 VEGF、EGF、FGF、PDGF 和 TGF-β，这会促进 TAM 的促肿瘤功能。作为炎症介质的主要制造者，与 CSF-1/CSF-1R 相关的 TAMs 是存在于肿瘤微环境中致炎性物质的关键起始者。CSF-1/CSF-1R直接促进肿瘤细胞释放炎症介质导致炎症级联反应，支持肿瘤细胞的持续进展。c. CSF-1/CSF-1R促进入侵和转移。当向静止的细胞添加CSF-1时，CSF-1R会迅速激活引发受体自磷酸化和与信号细胞相关的大量细胞骨架蛋白和胞质蛋白的酪氨酸磷酸化 [1]；巨噬细胞形态学改变也会迅速发生，伴随着细胞表面薄层膜扩展和鸟冠形状的形成以及巨噬细胞铺展，随后是细胞极化和运动增加。同时，CSF-1/CSF-1R促进肿瘤细胞形态学改变，促进粘附分子E-钙粘蛋白与细胞骨架蛋白的解离，释放复合物之间的肿瘤细胞连接，破坏细胞连接，并降低肿瘤细胞与其他肿瘤细胞表面粘附的能力，使其易于通过运动和增殖的能力从原位离开。

近年来，大量的CSF-1/CSF-1R通路抑制剂已投入临床实验，如H27K15，TG3003，Pexidartinib (PLX3397)。他们通过阻断CSF-1和CSF-1R的激活影响患者生存，如增强肿瘤免疫效应细胞(CD8/CD4比值增加)， 抑制M2-TAMs，抑制巨噬细胞数量。但仍存在一些问题。循环的CSF-1受到位于静脉的巨噬细胞的严格调控是正常的，尤其是肝脏的Kupffer细胞，它通过CSF–1R介导的内化和降解清除循环的CSF-1。如阻止CSF1/CSF-1R复合物的形成会导致治疗过程中的反弹效应，它会干扰CSF-1降解和内吞作用。除此之外，易吸收，细胞毒性等也影响药物的使用。

参考文献：

1. Huang L, Xu X, Hao Y: The possible mechanisms of tumor progression via CSF-1/CSF-1R pathway activation. Rom J Morphol Embryol 2014, 55(2 Suppl):501-506.

2. Wang Y, Zhang Q, Chen Y, Liang CL, Liu H, Qiu F, Dai Z: Antitumor effects of immunity-enhancing traditional Chinese medicine. Biomed Pharmacother 2020, 121:109570.

3. Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T et al: Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity 2014, 41(1):14-20.

4. Jenkins SJ, Hume DA: Homeostasis in the mononuclear phagocyte system. Trends Immunol 2014, 35(8):358-367

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