中药复方如何开展体外细胞实验

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纵观现代医学研究史,体内(in vivo)实验和体外(in vitro)实验是不可分割的两个方面。体外实验的结果最终要通过体内实验来证实其价值,由此可见体内实验尤为重要。然而,体外实验以实验条件和因素易于控制、需要时间短,便于进行作用机制的实验设计、避免体内实验的伦理学问题等优点发挥了极为重要的作用。

中药复方在中医及中西医结合临床实践中主要的用药方式。在体外实验中,主要有将中药复方或单方的提取物直接或精炼后加入体外细胞培养系统中,及中药血清药理学等方法。但这些方法有其优越性及局限性,使得用体外细胞培养来研究中药复方的工作进展较缓慢。尽管存在许多困难,但在这一领域中医学工作者仍做了大量工作。本文就这一领域对国内外的研究进展作一综述。

1 体外细胞培养系统

可采用外周血单个核细胞、巨噬细胞,也有的采用体细胞(如肾上腺嗜鉻细胞、人脐静脉内皮细胞、人乳腺细胞等),另一大类为肿瘤细胞[1,2]。确定适宜溶媒,再检查细胞活性。溶媒液体各不相同,一般中药复方直接用DMSO、PBS或细胞所需基础培养液相溶,或将其含药血清的培养液直接加入细胞。

中药复方作用时间各家报道不一,有与中药短时间作用(30min或2h),一般选择作用在24~72h[3,4]。中药的有效作用浓度依提取、制备方法的不同变化较大,但多数具有浓度依赖性。含药血清作体外细胞培养时,一般认为其浓度不应超过20%为宜。

2 细胞培养中药复方的制备及作用 2.1 复方提取物

对用于细胞培养的中药复方有较高的要求。用蒸馏水煎煮回流后,有的直接采用水煎液,更多的用水提醇沉提取液,过滤、浓缩,制成中药原液;或是用以上方法干燥成粉,用适宜溶媒制成供体外细胞培养用的中药原液。实验前还需用微孔滤膜或高温除菌。

2.1.1 水煎液或水提醇沉提取液直接作用于细胞系

以血府逐瘀汤制成的水煎剂与血小板和人脐带内皮细胞共育,在40mg/ml及80mg/ml浓度时可明显抑制二磷酸腺苷诱导的血小板表达糖蛋白复合物分子的表达,因而可抑制ADP对血小板的激活[5]。由人参、麦冬、丹参、赤芍、瓜蒌皮、金银花、苦参等组成的清心饮水煎醇沉提取液于大鼠心肌细胞培养3~5天,在2.5~10mg/ml浓度范围内能够剂量依赖性地减少感染心肌细胞乳酸脱氢酶、天冬氨酸氨基转移酶的释放,降低上清液中的病毒滴度,对心肌细胞搏动异常及细胞病变均有保护作用[6]。

运用流式细胞仪对临床治疗原发性肺癌的有效复方进行了拆方研究,24味中药的水提醇沉提取液10mg/ml处理肺腺癌细胞株24h,其中对细胞增殖指数抑制率在20%以上的4味中药中,有3味药是扶正药(绞股蓝、北沙参、人参),提示扶正法治疗肿瘤并不一定意味着传统意义上的“补”,一些补益药亦能直接抑制肿瘤细胞增殖[7]。

2.1.2 水煎液或水提醇沉提取液作用于不同细胞系,选取相同溶媒

日本学者将小柴胡汤(100μg/ml)对人肝癌细胞株(KIM-1)和胆管细胞癌株(KIC-1)在体外与不同浓度的小柴胡汤作用3天后,其生长受到不同程度的抑制。其50%抑制浓度的中药培养液的渗透压和p H值皆属于正常范围,并且该浓度范围内的小柴胡汤对健康人的外周血淋巴细胞和鼠肝细胞无抑制作用[8]。以小柴胡汤的各种主要成分以及另一种中药复方作为试剂对照,表明小柴胡汤的抑制作用明显强于其各种主要成分(P<0.05)和另一种中药复方(P<0.01),说明小柴胡汤的作用具有协同性和特异性。

2.1.3 水煎液或水提醇沉提取液浓缩粉作用于相同细胞系,选择不同溶媒

研究表明,同是藏药PADMA28分别用乙醇、甲醇、DMSO、PBS溶解分别作用在CEM-C7H2细胞。使用前离心2000r/min,10min,微孔滤膜过滤,保存在-20℃备用。等倍稀释后检测细胞毒作用,结果显示用醇稀释的优于PBS、DMSO,DMSO单独没有显示毒性作用。在1∶200~1∶500浓度范围内能够剂量依赖性地抑制增殖作用,使细胞处于G1期[9]。

RCM-101是一种含有18味中药的复方,沸水煎煮1~1.5h后,在50~60℃煎煮2~5h,1g溶液含有5g生药,冷冻干燥成粉。分别用乙醇、PBS溶解,使用前离心5000r/min,10min,微孔滤膜过滤,保存在-20℃备用。等倍稀释后检测细胞毒作用,选取1、10、100μg/ml浓度。在此范围内能够剂量依赖性地抑制前脂肪细胞的产生,但不同浓度的作用点不同,100μg/ml可以抑制COX-2的表达但不影响COX-1,其他的浓度则可以同时抑制COX-1与COX-2的表达[10]。

2.2 血清药理学

血清药理学方法的药物制备则是先给供体按临床用药量(志愿者),或临床等效剂量(动物)给药,给药一定时间后采血分离血清。含药血清被分离后,置于56℃水浴中灭活;若需长期保存,需冷藏于-20℃以下备用。

用扶正抗癌方(莪术、白术、苦参、白花蛇舌草)给大鼠灌胃,分离血清,处理人肝癌细胞SMMC7721一定时间后,发现癌细胞活力明显减弱,细胞内c AMP明显升高,细胞分泌白蛋白量增多,甲胎蛋白减少[11]。说明扶正抗癌方对人肝癌细胞具有诱导分化作用。

含益气活血补肾方药(黄芪、当归、生地黄、淫羊霍、大黄)的大鼠血清能明显抑制大鼠肾小球系膜细胞(MC)增殖;用中药血清处理MC 1h后,MC C-my基因表达活性明显降低,说明其机理可能与抑制MC原癌基因C-my表达有关[12]。该方中的黄芪、当归及大黄制剂已被证明能在体外抑制MC增殖[13]。提示该方药中某些有效成分可直接和(或)作用于机体后,引起体内代谢变化,某些代谢产物间接地抑制MC增殖。

含兔血清的四妙勇安汤是通过调节细胞周期的作用参与了对ECV304增殖的影响,提示四妙勇安汤可用于冠心病等缺血性疾病的治疗,以促进新生血管的生成和缺血损伤组织的修复[14]。同时,对四妙勇安汤进行拆方研究[15]发现不同浓度阿魏酸均可显著提高Brd U的掺入量,上调VEGF mRNA的表达,且在102ng/ml~104ng/ml之间呈一定的量效关系,显著促进体外培养的ECV304细胞的增殖。

3 中药复方在体外细胞培养的研究思路 3.1 中药复方用于体外细胞培养

中药复方或单方制剂用于体外细胞培养由来已久,但目前占主导地位的观点是:直接将中药复方制剂加入到体外细胞培养体系中,易于受到制剂的杂质、p H值、渗透压、电解质等因素影响。因此,在用此方法研究时,要对以上问题进行预实验,摸索出适合细胞生长的浓度。

在溶媒上主要选取适宜细胞生长的培养基或DMSO,但使用DMSO溶解时,要单独看DMSO对细胞是否有毒性,各文献报道不一。找取适宜的溶媒后,等倍稀释,检测是否对细胞有毒性,选取合适的浓度范围,进行实验。一般用滤膜灭菌,保存在-20℃以下备用。多篇中药单方或复方直接加入进行体外细胞培养的文献现大多为阳性结果,且多与体内实验结果吻合。其中一篇日本学者研究小柴胡汤对肝癌细胞株抑制作用的文章,设计严谨,有正常细胞和其他中药制剂作对照,颇具说服力。虽然,以上实验结果似乎与目前占主导地位的观点不太一致,但是在国外文献报道日益增多。

3.2 中药血清药理学用于体外细胞培养

近几年发展起来的中药血清药理学(不少作者意见,应改为含药血清法)方法,避免了中药复方制剂直接体外用药的一系列干扰因素,其特点为不但能反映中药(母体药物)及其可能的代谢产物的药理作用,而且还能反映有可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用,已成为当今中药复方研究的一个重要动向。但作为一种新兴的实验方法,在技术上还需探讨、规范和完善。

药理血清的制备、确定药物的时效关系以及量效关系一直是中药药理研究的焦点。但不同种属的实验动物对药物敏感程度不同,不同动物对不同药物的吸收和代谢速率不同;采血时间、含药血清的处置、添加方式等问题仍有待解决。中药复方并非单一成分发挥药理学作用,其实验稳定性、重现性和标准化也是血清药理学面临的问题[16]。

4 体外细胞培养对于中药复方研究的价值

尽管在以上方法在操作上的意见尚不统一,但利用体外实验来研究中药复方正越来越受到重视,在国外一些杂志也有相应的报道[17]。

体外细胞培养是医学研究的重要手段,对于中西医结合研究同样是不可缺少的。研究目的多限于验证临床有效的复方,或探索其可能机理、量效关系,但多数文献实验设计的全面性与严谨性欠深入。因此,无论用哪种方法体外实验来研究中药复方,都要进行全面合理的设计。

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