这一地牛蛙暴毙！分离出6个链球菌株！陈昌福：药敏实验非常必要，用药9天停止死亡！

文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军 王晓娟 陆珍珠

陈昌福老师寄语

最近，收到来自安徽省某牛蛙养殖基地的患病牛蛙，据养蛙业者介绍疾病导致了比较大的死亡率。我们从中患病牛蛙中分离、纯化到了无乳链球菌，证明疾病是有这种链球菌引起的。

接着，完成了对获得的几个分离菌株的药物抑菌试验，结果找到几种能有效抑制这种致病菌繁殖与生长的抗微生物药物。从中选择了一种允许在水产养殖动物中使用的抗微生物药物，对患病牛蛙连续用药9d后，控制住了养殖池塘中牛蛙的死亡，取得了比较好的药物治疗效果。

文章的结尾处还讨论了感染养殖牛蛙的无乳链球菌可能来源，鉴于无乳链球菌已经被证明是人畜共患病的致病性病原，带有链球菌的牛蛙可能对消费者产生的危害。建议养蛙业者要注意管理好生活污水，避免引用生活污水而将其中存在的无乳链球菌带进养蛙的水体中。

牛蛙中无乳链球菌分离

药物敏感性及其危害性分析

摘要：本文报告从安徽省某牛蛙养殖基地送来的患病牛蛙（Rana catesbeiana）的肾脏中分离、纯化到无乳链球菌（Streptococcus agalactia），在完成分离菌株，对多种抗微生物药物的药物敏感型检测的基础上，指导牛蛙养殖业者采用对分离菌株具有较好抑菌效果的10.0%恩诺沙星粉（水产用）治疗患病牛蛙，连续用药9d后，养殖池中牛蛙停止了死亡的现象，获得了理想的药物治疗效果。同时，文章中还分析了感染患病牛蛙无乳链球菌的来源及其可能对人类健康造成危害状况的初步分析。

关键词：牛蛙；无乳链球菌；细菌性败血症；药敏试验；人畜共患病

随着我国蛙类养殖业的兴起，蛙类病害问题也日渐突出。有研究结果表明，养殖蛙类的疾病种类是比较多的。其中生物致病性病原主要包括由箭毒蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）引起的真菌性疾病；由蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等致病性细菌引起的细菌性疾病、由曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni）的原尾蚴或裂头蚴阶段虫体寄生引起的寄生虫病等。还有一些养殖环境因素可以造成非生物性疾病。

在人工养殖环境下，各种细菌性疾病仍然是危害养殖蛙类的主要疾病。目前已报道的致病菌如脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium menigosepticum）可引起牛蛙出现所谓的“歪脖子病”，气单胞菌属（Aeromonas）的多种细菌，如嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、点状产气单胞菌（A.punctata）和温和气单胞菌（A.sobria）可引起牛蛙红腿、腹水以及白内障等多种细菌性疾病的典型症状。另外还有迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、非霍乱弧菌（Noncholera vibrios）、米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）和无乳链球菌（Streptococcus agalactia）等致病性细菌还可以引起蛙类败血症。

本文报告从安徽省某牛蛙养殖基地送来的患病养殖牛蛙中，分离、纯化到无乳链球菌的几个分离菌株，在对多种抗微生物药物完成药物敏感型检测的基础上，指导牛蛙养殖业者药物治疗牛蛙疾病并观察药物治疗的效果，最后分析了感染养殖牛蛙无乳链球菌的来源及其可能对人类健康造成危害状况。

01

材料与方法

1.1供试患病牛蛙来源

本研究中的供试患病牛蛙，由安徽省某牛蛙养殖基地牛蛙养殖业者通过快递方式送来实验室，委托我们协助诊治的活体牛蛙（图1）。

图1通过快递送到实验室的患病牛蛙状态

1.2病原菌的分离、纯化

在无菌条件下，对患病牛蛙用70.0%的酒精进行体表消毒后，进行解剖患病牛蛙。使用接种环，从肾脏与大脑中分离细菌，接种到脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）上，放于28℃恒温培养箱中培养36h后，挑取培养基上长势良好的菌落进行纯化培养，并保存备用。

1.3病原菌的鉴定

取活化菌体制作涂片，对菌体进行革兰氏染色，观察形态特征。并且将纯化后的菌株邮送到某生物工程公司，委托其利用分子生物学技术对分离菌株完成16S rRNA基因分子鉴定工作。

1.4分离菌株的药物敏感性检测

采用市售14种抗微生物兽药作为本试验中的供试药物。供试药物的名称与批号如表1所示。

表1本试验中供试药物名称与批号

编号

供试药物

生产批号

1

硫酸新霉素粉（水产用）50%

C20230301

2

硫酸新霉素粉（水产用）5%

C20230312

3

恩诺沙星粉10%

4

恩诺沙星粉（水产用）5%

5

恩诺沙星粉（水产用）10%

D20220803

6

氟苯尼考粉10%

7

氟苯尼考粉（水产用）10%

D20230302

8

盐酸多西环素粉10%

9

盐酸多西环素粉（水产用）10%

D20230304

10

盐酸土霉素可溶性粉50%

D20221206

11

氨苄青霉素可溶性粉20%

12

甲砜霉素粉（水产用）5%

D20230316

13

阿莫西林可溶性粉10%

C20230342

14

复方阿莫西林粉10%

B20230108

1.5最小抑菌浓度（MIC）的测定

依日本化学疗法学会制定的标准法进行。即将供试14种抗微生物药物分别采用适宜的容媒预溶后，用灭菌生理盐水按照上述制剂中抗微生物药物的含量，分别稀释至1000~0.25mg/L的２倍稀释的13个浓度。然后用脑心浸液培养基（BHI，Difco）将各浓度的药物液稀释10倍，从而使培养基中的各种药物的浓度达到100.0~0.025mg/L的２倍稀释的13个浓度。最后向每支盛有2.9 mL培养基的试管中加入0.1 mL浓度为1.2×10 6cfu/mL活菌液，在28℃条件下连续培养3d，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为某种抗微生物药物对分离菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

02

结果

2.1致病性细菌所属种类

菌体涂片经过革兰氏染色，证实属于革兰氏阳性菌，菌体为圆形和卵圆形，链状或成对排列。经利用分子生物学技术完成16S rRNA基因分子鉴定结果是分离菌株属于无乳链球菌。

2.2分离菌株对各种抗微生物药物的MIC

在实验室中先后完成了从患病牛蛙肾脏和大脑中分离、纯化到6个分离菌株。利用这些分离菌株对14种供试抗微生物药物兽药制剂完成的药物敏感性检测，结果如表2所示。从表2所示结果可以看出，属于无乳链球菌的6个菌株对供试药物中氨苄青霉素、阿莫西林和复方阿莫西林等几种抗微生物兽药存在较高的敏感性，而分离菌株中已经有菌株对部分供试抗微生物兽药产生了不同程度的耐药性，而且有多个分离菌株已经对供试抗微生物药物制剂，产生了较强的耐药性。

表2抗微生物药物制剂对患病牛蛙体内分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）

编号

抗微生物药物制剂种类

最小抑菌浓度

（MIC，mg/L）

1

硫酸新霉素粉（水产用）50%

12.5~50.0

2

硫酸新霉素粉（水产用）5%

25.0~100.0

3

恩诺沙星粉10%

12.5~50.0

4

恩诺沙星粉（水产用）5%

6.25~25.0

5

恩诺沙星粉（水产用）10%

3.13~6.25

6

氟苯尼考粉10%

25.0~50.0

7

氟苯尼考粉（水产用）10%

12.5~25.0

8

盐酸多西环素粉10%

25.0~50.0

9

盐酸多西环素粉（水产用）10%

25.0~50.0

10

盐酸土霉素可溶性粉50%

12.5~25.0

11

氨苄青霉素可溶性粉20%

1.56~6.25

12

甲砜霉素粉（水产用）5%

12.5~50.0

13

阿莫西林可溶性粉10%

3.13~12.5

14

复方阿莫西林粉10%

3.13~12.5

2.3药物治疗患病牛蛙的效果

根据对14种抗微生物兽药制剂对患病牛蛙中无乳链球菌的MIC检测结果，向牛蛙养殖业者建议采用10.0%恩诺沙星粉（水产用）作为治疗患病牛蛙的药物。即选择对从患病牛蛙中获得的无乳链球菌具有较好抑菌效果的抗微生物兽药，作为患病牛蛙的治疗药物，从牛蛙养殖业者处得到的回馈结果是，用药后均获得了非常理想的药物治疗效果。

简而言之，具体做法就是从患病牛蛙体内分离、纯化到致病性无乳链球菌，针对无乳链球菌分离菌株完成了多种抗微生物兽药的药物敏感性检测，并且根据药物敏感性测定结果，选择用量少、效果好的10.0%恩诺沙星粉（水产用），作为在对患病牛蛙治疗用抗微生物药物，最后根据养殖牛蛙的总体重，计算用药量后均匀地拌和在饲料中投喂患病牛蛙。将全天的用药量拌和在1次投喂的牛蛙饵料中，每天投喂1次药物饵料，连续投喂9d为一个给药疗程。在投喂药物饵料期间，采用质量较好的二氧化氯作全池泼洒用消毒剂，隔天消毒池水1次，在一个疗程中共消毒池水2次，消毒的目的在于消灭养殖水体中部分致病菌。

03

已经有大量的研究结果证明，有多种致病性细菌能引起养殖牛蛙的细菌性疾病，本研究从患病牛蛙中分离到无乳链球菌，也是已经有人报道过的危害养殖牛蛙的致病性细菌。 根据人们对无乳链球菌流行病学的研究资料，环境中的无乳链球菌主要是来自牛和人，也有人从马、猪、犬、蛙和鱼类中分离到。 无乳链球菌是人体中的常见细菌，有研究报道称50.0%以上的健康人的粪便以及25.0%健康人泌尿生殖系统带有这种细菌。 还有研究报告称来自人体的无乳链球菌的毒力较来源于牛的菌株毒力更强。 还有人采用来源不同的菌株，完成的毒理试验结果证明。 来源于牛的无乳链球菌株感染鱼类不成功，而来源于人体的无乳链球菌则可以成功地感染鱼类。

虽然我们尚不知道这次从患病牛蛙中分离获得的无乳链球菌究竟来源哪里，但是，管理好人类的生活污水，不要让人类生活污水污染养蛙水体，应该是预防养殖牛蛙链球菌病的有效措施之一。另外，在消费牛蛙时一定要煮熟后再食用，避免被无乳链球菌感染。

从利用获得的6个分离菌株作为供试菌株，完成的菌株对14种抗微生物药物的敏感性检测结果证明，这些供试菌株对氨苄青霉素、阿莫西林等抗微生物药物具有比较高的敏感性，这可能是因为无乳链球菌属于革兰氏阳性菌的缘故。但是，因为氨苄青霉素、阿莫西林等抗微生物药物虽然属于兽药，但是，尚未被允许应用在水产养殖动物疾病治疗中。最后采用了抑菌效果尚可的10.0%恩诺沙星粉（水产用），作为了本次治疗患病牛蛙疾病的药物。由养蛙者返回的信息得知，虽然在用药后死亡蛙数量就开始减少，但是直到用药7d时，养殖池中还有少数牛蛙死亡，继续投喂药物饵料至低9d，养殖牛蛙就停止了死亡现象。

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作者：华中农业大学 陈昌福 武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军 王晓娟 陆珍珠

编辑：郑燕云

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