普渡大学研究团队成功开发叶酸靶向的miR-34a疗法

近日，普渡大学的研究人员已经开发出一种新型的癌症治疗方法，利用修改过的微RNA（miR-34a）来阻止癌细胞的分裂。在小鼠的临床前测试中，使用完全修改的、针对肿瘤的miR-34a治疗在21天的评估期内停止了肿瘤的生长，并在某些动物中完全治愈。相比之下，未经治疗的肿瘤在同一时间内增长了三倍。这种miRNA构建物对免疫系统也是不可见的，通常情况下，免疫系统会攻击体内引入的双链RNA。

研究负责人安德烈亚·卡辛斯基（Andrea Kasinski），普渡大学生物科学威廉和帕蒂·米勒副教授告诉GEN，如果可以成功完成所需的广泛的疗效、毒性和药理学研究，临床试验有可能在两年内开始。最初的临床重点将放在三阴性乳腺癌（TNBC）和非小细胞肺癌（NSCLC）上。

卡辛斯基和她的同事在《Oncogene》杂志上发表了他们在小鼠研究中的发现，题为“第一类具有卓越稳定性、活性和抗肿瘤效力的全修饰miR-34a”，他们在其中总结道：“这些结果有望重新激发miR-34a作为抗癌药物的活力，为临床测试提供了有力的理由。”卡辛斯基进一步表示：“毫无疑问，RNA治疗领域正在迅速扩展。我们发表的工作有望彻底改变这个领域。”

微RNA是一种短小的非编码RNA，具有同时下调多个基因的独特能力，因此miRNA基于的治疗可能成为治疗各种疾病的有前途的工具。在肿瘤抑制剂miRNA中，最具临床意义的之一就是miRNA-34a，它调控着多条癌症途径，控制细胞增殖、迁移和侵袭、抗凋亡和免疫逃逸，研究人员指出。

miRNA-34a有效地像汽车的刹车一样，停止了细胞分裂，卡辛斯基说。但是，虽然健康细胞中富含miRNA-34a，但在许多癌细胞中，其存在量大大减少。研究人员进一步指出：“毫无疑问，大量的癌症患者将受益于miR-34a的替代。”然而，要实现这一点，必须克服miR-34a稳定性差、非特异性递送和递送相关毒性等挑战。

递送的特异性和无毒性的挑战，以及RNAs的稳定性差，导致需要高剂量和频繁的给药，这一直是开发治疗性miRNA-34a候选药物的主要障碍，卡辛斯基进一步指出：“2013年启动的第一项使用微RNA的临床试验导致了与递送载体相关的严重免疫相关毒性事件，高剂量需要看到效果，和/或未修饰的微RNA可能引发免疫反应。”

研究团队花费了十年的时间来克服这些关键挑战，卡辛斯基补充说。为了确保修改过的miRNA-34a被传送到癌细胞，团队将双链RNA附着到维生素叶酸的分子上。我们体内所有细胞的表面都有叶酸受体，它们会结合叶酸并将其吸引到细胞内，但许多癌症细胞（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和宫颈癌）的细胞表面上的叶酸受体远远多于健康细胞。科学家在论文中解释说：“我们使用了叶酸-miRNA递送策略，允许miRNA特异性地递送到过度表达叶酸受体（FR）的肿瘤，而无需将miRNA包装在载体内。”这种方法消除了“非特异性、通常具有毒性且庞大的递送载体”，卡辛斯基向GEN进一步解释说：“我们是第一组使用配体介导的递送方法来递送微RNA的团队。”

为了提高治疗的持久性，团队通过在RNA链的长度上添加几个小的原子团簇来稳定了miRNA-34a。团队的修改是基于FDA批准的用于类似的短干扰RNA的化学结构进行的。小鼠模型中的实验显示，完全修改的miRNA-34a在引入后至少可以持续120小时。

“第二个障碍，涉及完全修改miRNA，还大大降低了治疗的成本，但也有望提高患者的依从性，提高生活质量，并减少或消除免疫原性，”卡辛斯基进一步解释道：“完全修改的miRNA的稳定性>400倍于未修改或部分修改的版本。这增加了治疗的持续时间，减少了给药的频率。较少的剂量将对患者有重大好处，使他们可以更多时间与家人在一起。这也将转化为成本节省，因为需要的治疗更少。”

在他们的研究报告中，团队展示了叶酸偶联的FM-miR-34a（FM-FolamiR-34a）可以穿透肿瘤的密集组织并结合到细胞表面的叶酸受体上，然后被内化到囊泡中。一旦进入细胞内，miRNA-34a会逃脱囊泡，并起到减缓细胞分裂的作用。卡辛斯基补充说：“使用这种方法可以以比用于失败的临床试验的载体低10-100倍的剂量特异性递送到预期的细胞。”这种方法可以显著降低给药剂量，有助于降低潜在的毒性（尽管我们尚未确定毒性剂量），随着疗法的进展，这也将降低成本，因为需要的治疗更少。”

使用叶酸靶向而不是封装有多重组分的复杂纳米粒子有多重好处，她进一步告诉GEN。叶酸是人类体内的天然物质，这有助于避免使用复杂的纳米粒子可能会导致的潜在毒性。“…最近FDA批准了由共同作者菲利普·洛（Philip Low）博士开发的叶酸偶联成像试剂，用于帮助外科医生更好地识别肿瘤边界，这是一个出色的工作，突显了叶酸偶联物在人体中的安全性，以及叶酸偶联物在人类患者中的迅速和特异递送。”

团队在培养细胞中进行了测试，以及小鼠的体内临床前试验。结果证实，叶酸偶联的完全修改的miRNA-34a强烈抑制了至少三个已知推动癌症和对其他癌症疗法产生耐药性的基因的活性，这些基因是MET、CD44和AXL。“报告的研究证实，FM-miR-34a有效抑制了增殖和侵袭，引起了内源性靶基因长达>120小时的持续下调，”团队指出。“…在单剂FM-FolamiR-34a系统给药后的五天内，生物学靶点（MET、CD44和AXL）的沉默水平达到了常见的单基因siRNA靶向后观察到的水平。”他们表示，这些结果表明“化学修饰不仅不妨碍miR-34a下调已知/预测靶点的能力，而且增强了这种能力”。

评估多剂量FM-FolamiR-34的实验证实，治疗可以减缓或逆转肿瘤的生长。21天的给药期结束时，两只治疗的小鼠的肿瘤体积缩小了约45-75%，其中一只小鼠完全治愈。“重要的是，在整个研究过程中，体重没有发生显著变化，表明FM-FolamiR-34a的安全性，”研究人员指出。额外的测试表明，该治疗没有引发接受者的免疫反应。“全修饰还有助于防止免疫反应，”卡辛斯基向GEN评论道。“…身体不会将这些完全修饰的RNA识别为外来物质，因此它们能够进入细胞并‘完成工作’，而不触发免疫系统，这是第一代进入临床试验的微RNA疗法的一个关键问题。”

尽管需要进一步的研究来验证早期结果，但总体发现表明，该团队的方法可以在对抗已经对药物产生耐药性的癌症时单独或与现有药物结合使用时是有效的。卡辛斯基指出：“当我们获得数据时，我感到非常激动。我相信这种方法比目前的标准治疗更好，有患者会受益于此。”

研究人员的下一步将是在其他模型系统中测试治疗方法，并进行大规模毒性研究。“一些模型将用于评估各种其他过度表达叶酸受体的肿瘤的疗效，如肺癌、结肠癌和卵巢癌，以补充我们在乳腺癌方面的工作，”卡辛斯基指出。

团队计划将最初的临床指标集中在TNBC和NSCLC上，因为迄今为止，大部分数据都是在这两种肿瘤中获得的，它们中的80%过度表达叶酸受体，她补充道。卵巢癌也是一个可能的选择，因为多达80%的卵巢癌也过度表达叶酸受体，尽管该药物尚未在该肿瘤类型中进行测试，卡辛斯基承认。然而，“因为我们正在使用的小RNA已被证明在缺乏p53信号的肿瘤中非常有效，这种情况发生在50-90%的NSCLC、TNBC和卵巢癌中，我们预计在这些癌症中将取得出色的结果。”

她进一步表示，其他叶酸共轭物也很可能被证明是特异性和安全的。“…叶酸共轭物比纳米粒子小得多。这使得治疗RNA能够渗透肿瘤微环境的密集结构，将RNA递送到肿瘤内部，比纳米粒子可以实现的更深入。”由于叶酸作为靶向配体的简单性，生成叶酸所需的合成化学比复杂纳米粒子更容易，她指出。使用叶酸作为靶向配体的另一个主要好处是它与叶酸受体结合非常紧密，这是最过度表达的受体之一，“通常每个细胞代表着一百万以上的受体”，卡辛斯基解释说。“因此，在单次给药后，由于高亲和力和拷贝数，每个患病细胞可以获得超过一百万份miR-34a的拷贝。”

工作还将继续改进miRNA构建物。卡辛斯基指出：“我们有多个想法，可以进一步改进这种药物。我坚信，文中描述的药物符合获得批准所需的严格标准。也就是说，在实验室里，我们正在解决三个额外的挑战，如果成功，将进一步改进这个药物。这些包括额外的化学反应，可以帮助促进递送的代理。”

团队还积极参与开发提高治疗的循环半衰期的方法。“虽然小尺寸对于穿透肿瘤组织很有好处，但导致从体内快速清除。我们已经找到了一种方法，可以在保持小尺寸和简化化学的情况下增加循环半衰期。”在团队成功稳定RNA之前，这并不是一个考虑因素，否则RNA将被降解，卡辛斯基指出。“我们在稳定RNA方面取得的成功现在让我们考虑了这个选项。如果成功，可以进一步降低给药和总成本。”由于叶酸靶向策略只适用于过度表达叶酸受体的肿瘤，团队还正在研究用于递送到其他肿瘤的其他小型配体。

卡辛斯基表示：“虽然使用小RNA作为治疗手段的想法并不新鲜，但上述挑战一直阻碍了它们的进展。”她继续说，尽管2018年批准了第一种小RNA，一种用于治疗肝脏疾病的短干扰RNA（siRNA），但目前没有用于肿瘤学的RNA治疗药物。“高度预期我们在肿瘤学领域的工作将为更好地理解有效药物所需的条件开辟道路。尤其是对于癌症，使用这种方法，可以递送任何可能靶向任何基因的小RNA。对于治疗癌症，使用多种小RNA也不在话下，特别是因为癌症是一种非常异质性的疾病。”

编辑：周敏

排版：李丽