PLoS Genet|福建师范大学欧阳松应团队在CRISPR-Cas效应蛋白Cas12g切割RNA底物分子机制方面取得新进展

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 系统是细菌体内的获得性免疫系统，用于抵抗外源核酸物质的侵染。第二大类CRISPR-Cas系统仅需单个Cas效应蛋白即可完成对外源DNA或RNA的降解，因此可以广泛用于核酸编辑工作。2019年，研究者鉴定并报道了多种新型的第二大类V型Cas12家族的效应蛋白，Cas12g是其中仅有的具备核糖核酸酶 (RNase) 活性的效应蛋白 (Yan et al., Science, 2019)。在以往研究中，Cas12家族的效应蛋白均通过保守的RuvC核酸酶结构域靶向切割DNA，而Cas12g的发现打开了一个新的可能性，即使用Cas12g作为一种高效的RNA编辑工具。因此，揭示Cas12g蛋白如何被靶核酸激活并发挥其RNase活性的分子机制可为今后应用与改造CRISPR-Cas12g系统提供理论依据。尽管此前畅磊福研究团队已报道Cas12g与靶核酸形成复合物的结构与功能研究 (Li et al., Nature Chemical Biology, 2021)，但Cas12g蛋白是如何被激活并切割靶核酸底物仍存在一些尚未研究清楚的问题。

近日，福建师范大学欧阳松应教授团队在PLoS Genetics上在线发表了题为 Structural transitions upon guide RNA binding and their importance in Cas12g-mediated RNA cleavage 的研究论文，深入分析了Cas12g蛋白结合sgRNA前后的构象变化及切割RNA底物的分子机制，为应用Cas12g开展RNA编辑工作提供了新的理论指导。

本研究运用X-ray和Cryo-EM技术分别解析并报道了Cas12g效应蛋白（apo-Cas12g）和Cas12g-sgRNA二元复合物两种状态下的结构及特征；另外，结合分析畅磊福研究团队报道的Cas12g-sgRNA-RNA三元复合物结构 (Li et al., Nature Chemical Biology, 2021)，揭示了Cas12g结合sgRNA、靶RNA的一系列重要的构象变化。首先，在Cas12g与sgRNA结合后，RuvC、Helical 1和Helical 2结构域的构象发生重排，形成一个蛋白表面带大量正电荷的中心通道，用以容纳sgRNA；随后，组成中心通道的多个结构域进一步产生位移从而使得中心通道的容积扩大，以便靶RNA的结合。在此过程中，RuvC结构域的盖状基序（lid motif）的构象变化对于调节该结构域的RNA底物切割活性至关重要。在apo-Cas12g结构中，盖状基序与Helical 1结构域相互作用并覆盖于RuvC结构域的酶活位点上方，随着sgRNA结合，lid motif被诱导产生了一个helix-to-loop的构象变化，盖状基序发生旋转从而部分暴露RuvC的酶活位点，为底物的结合和切割做准备；接着，靶RNA的结合进一步促进了盖状基序的构象变化，使得RuvC的酶活位点彻底暴露，从而完全释放了Cas12g的RNA底物切割活性。

此外，在畅磊福研究团队报道的Cas12g复合物结构中，Helical 1结构域的大段区域（aa 220-354）虽被证明对Cas12g的RNA底物酶切功能至关重要，但由于其密度缺失尚待深入研究分析。在本研究中，apo-Cas12g的结构完整呈现了Helical 1结构域，并进一步在该结构域中鉴定出两个相邻的锌指基序结构；进一步结合Cas12g-sgRNA二元复合物结构，研究人员在Cas12g蛋白中鉴定出三种不同类型的锌指基序结构，其中Zn2+A (HCCC型) 和 Zn2+B (CCHC型) 位于其Helical 1结构域上，而Zn2+C (CCCC型) 则位于其Nuc结构域上。底物切割实验表明，任意破坏其中一种锌指基序结构均可严重影响Cas12g的底物切割活性。同时，通过结构比对发现，包含Zn2+A 和 Zn2+B 两个锌指基序结构的Helical 1结构域在sgRNA结合后向中心通道位置移动；当结合靶RNA时，该结构域进一步移动至中心通道出口处并与靶RNA相互作用。由此可见，锌指基序结构在Cas12g发挥其酶活功能时具有重要作用。

最后，作者给出了一个多步模型来阐释Cas12g的激活及切割RNA底物的具体过程。

总的来说，本研究在前期研究者的基础上进一步阐述了Cas12g结合sgRNA前后的构象变化，分析了RuvC核酸酶结构域激活过程的多步机制，并提出了Cas12g的锌指结构基序在其切割RNA底物中的重要作用，这不仅增加了对Cas12g靶向切割RNA底物的分子机制的理解，也为基于CRISPR-Cas12g系统的核酸编辑与检测工作提供了新思路。

据悉，福建师范大学为该论文的第一完成单位，福建师范大学生命科学学院、南方生物医学研究中心博士生刘梦茜、李泽凯为论文的共同第一作者，福建师范大学欧阳松应教授、张博副研究员为论文通讯作者。