Cell | 超迷你CRISPR系统AsCas12f的全面改造升级

撰文 | 木兰之枻

体型过大一直是CRISPR-Cas基因编辑系统的核心技术瓶颈之一，因此研究者不断尝试在细菌、古细菌、噬菌体甚至真核生物中进行数据挖掘，以期能发现小型CRISPR-Cas系统以推动基因编辑的更广泛应用。2016-2020年间，Jennifer Doudna实验室在古细菌和噬菌体中发现了更小体积的CRISPR系统-CasX（986氨基酸）和CasΦ（Cas12j）系统（700-800氨基酸）【1-3】（ ；）。此后研究者在原核生物IS200/IS605转座子超家族中发现了新型核酸内切酶OMEGA系统，其中的TnpB和IscB/IsrB分别被认为是CRISPR-Cas12和Cas9系统的祖先。这类核酸内切酶体积更小（400-700氨基酸），并具有类似的RNA引导且PAM/TAM依赖的双链DNA切割活性【4-7】（； ； ；）。2023年，张锋实验室还首次证实了真核生物中类CRISPR系统的存在（）【8-9】。此外，2020年Virginijus Siksnys实验室发现一种超迷你的Cas12f核酸酶（400-700氨基酸），其在体外具有PAM依赖的双链DNA切割活性【10】。自此开始， CRISPR-Cas12f系统吸引了众多研究者的目光，并不断被改造应用于哺乳动物的基因编辑研究（；；； ；；；；；）【11-19】。不过长期以来，Cas12f系统的改造和应用仍缺乏全面性和系统性，需要进一步的探索。

近日，来自日本东京大学的Osamu Nureki实验室、京都府立医科大学的Atsushi Hoshino实验室和自治医科大学的Tsukasa Ohmori实验室合作在Cell发表题为An AsCas12f-based compact genome-editing tool derived by deep mutational scanning and structural analysis的论文。文章通过结构解析、结构优化和深度突变扫描等策略，对噬热菌Acidibacillus sulfuroxidans来源的AsCas12f进行了全面系统的改造和优化。文章还证实，优化后的enAsCas12f可在细胞和小鼠模型中实现目标位点的高效基因敲除、基因敲入和基因激活。

为指导超迷你AsCas12f系统的优化与改造，研究者首先通过冷冻电镜技术对其进行结构解析。结果显示，AsCas12f会形成二聚体，其中REC和RuvC结构域的互作是二聚体形成的关键，此外，sgRNA与AsCas12f的结合也促进了二聚体的形成。

已知原始AsCas12f在人源细胞系中的基因编辑效率偏低，因此研究者采用了深度突变扫描（DMS）这一蛋白质工程策略对AsCas12f进行饱和突变筛选。结果显示>200种单氨基酸替换能增强其基因编辑效率，其中S188H和D195K点突变主要通过促进AsCas12f与靶位点DNA的结合改善了基因编辑效率。以S188H和D195K点突变为基础，研究者对多种点突变进行了组合筛选，结果显示F48Y/S188H/V232A/E316M和I123H/D195K/D208R/V232A四点突变（enAsCas12f，分别命名为AsCas12f-YHAM和AsCas12f-HKRA）在人源细胞内具有更高的编辑效率。除蛋白质工程改造外，研究者还对sgRNA进行了优化，发现删除茎环3，4，5后的sgRNA_ΔS3–5_v7能进一步提升编辑效率。

随后研究者通过冷冻电镜技术对突变体AsCas12f-YHAM、 AsCas12f-HKRA与sgRNA_ΔS3–5_v7及靶位点DNA形成的复合物进行结构解析以探究基因编辑效率提升的结构基础。结果显示，突变体的整体结构与原始AsCas12f相似，sgRNA_ΔS3–5_v7则保持了与AsCas12f稳定结合的能力。AsCas12f-YHAM突变体中，F48Y.1（单体1）点突变位于二聚体界面处，能与G57.2（单体2）形成氢键而增强二聚体的稳定性。S188H.1点突变能促进靶位点DNA解旋，E316M.1和E316M.2能与T239/A241形成额外的疏水相互作用而增强复合物的稳定性。AsCas12f-HKRA突变体中，I123H.1和D195K.1点突变能增强gRNA-靶DNA杂合链的稳定性，D208R.1点突变则扮演与S118H类似的角色。此外，D208R.2与sgRNA骨架间有静电互作，能增强复合物的稳定性。不过结构解析对V232A点突变的意义缺乏足够的证据支持，这意味着单纯的结构解析并不能完全揭示突变体增强基因编辑的机制。

研究者还对AsCas12f突变体的PAM特异性和内源编辑活性进行了系统性的比较分析，发现无论突变与否，PAM位点均为NTTR。编辑效率方面，原始AsCas12f仅3.0%，而突变体AsCas12f-YHAM和AsCas12f-HKRA的编辑效率提升至40.8%和44.7%。研究还指出，AsCas12f突变体的编辑效率与Cas12a相当，略低于SpCas9。在治疗性位点PCSK9、ANGPTL3和TTR，AsCas12f-YHAM、 AsCas12f-HKRA在2/3位点上的编辑效率高于SpCas9。GUIDE-seq实验还指出，AsCas12f-HKRA的脱靶风险与SpCas9相当。

最后，研究者还结合AAV递送系统对AsCas12f突变体的应用潜力进行了系统探索。在DMD患者iPSCs中，AsCas12f-HKRA突变体能有效恢复dystrophin蛋白表达。小鼠在体实验中，研究者证实AsCas12f-HKRA能有效降低血清中transthyretin的表达水平。此外，AsCas12f-HKRA还能实现EGFP和凝血因子F9的在体定点敲入，从而实现血友病小鼠模型的基因治疗。研究者还将AsCas12f-HKRA与转录激活因子p65-HSF1组合，实现了小鼠体内目标基因的转录激活。

总体而言，研究者通过结构解析、蛋白质工程改造以及sgRNA优化，对超迷你AsCas12f系统进行了全面升级，有效提升了其基因编辑效率，并成功用于细胞和动物水平的基因敲除、定点敲入及转录激活研究。改造后的enAsCas12f在细胞和动物模型中超强的基因敲除和敲入编辑效率、高效的基因激活能力，再兼具“体型”上的巨大优势，展现出了在临床治疗应用的巨大潜力。

参考文献

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https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.08.031