Baran等组Nature：Portimines的高效全合成和抗癌活性机制

导读

最近，美国斯克利普斯研究所Phil S. Baran课题组、Christopher G. Parker课题组、Luke L. Lairson课题组合作报道了portimineA、B的高效全合成和抗癌活性研究。相关研究成果发表在《自然》杂志上（Nature2023, DOI: 10.1038/s41586-023-06535-1）。该全合成路线应用了两相萜类合成、环-链互变异构、骨架重组、通过自保护实现保护基最少化等策略，为生物活性研究提供了足够的原料和便捷衍生化。生物活性研究显示portimine A、B能高效高选择性诱导人源癌细胞株凋亡，并且在体内肿瘤清除模型中也有效。化学蛋白质组学实验进一步确定portinine A的主要靶点是60S核糖体输出蛋白NMD3。

背景介绍（Fig. 1）：

几十年以来，环亚胺毒素引起了科学界的广泛兴趣，其具有独特的化学结构和强效生物活性。该类化合物中的部分化合物的治疗潜力，例如pinnatoxins、spirolides、gymnodimines类，因具有体内高神经毒性而受到限制。Portinine A (PA, 1)和Portinine B (PB, 2)是在2013年和2018年从底栖甲藻Vulcanodinium rugosum中分离得出的两个更紧凑环亚胺毒素（Fig. 1, 绝对构型于2019年确认）。初步生物活性研究显示，与经典环亚胺毒素相比，PA (1)在多个癌细胞株中表现出强效细胞毒性（约3 nM），且在小鼠体内具有低急性毒性，这表明PA具有成为抗癌药的潜力。此外，最近的报道已经证实PA是一种具有最小坏死活性的选择性细胞凋亡诱导剂。然而，其强效活性的作用机制尚不明确。为了进一步探索其生物活性作用机制，需要获取足够原料，但是其生物提取产量低，因此化学合成似乎是实际获得这种分子的唯一方法。该分子结构复杂，其中五元亚胺环以螺环和稠合的形式嵌入高氧化态全碳三环大环核心骨架中，合成难度极大。同时，其具有不寻常的外围氧化态，例如邻近五元亚胺环的C5位羟基立体中心和不稳定的中环缩酮片段，这些特征进一步增加了其合成难度。

最近，斯克利普斯研究所Phil S. Baran课题组首次完成了portimine A (1)、B (2)的全合成，并与同所的Christopher G. Parker课题组、Luke L. Lairson课题组合作研究了其抗癌活性并揭示其抗癌机制。该全合成通过将多种商业可得片段转化成关键前体3，然后经炔烃关环复分解反应（RCAM）闭合大环，最后构建各种氧化态，实现portimines的规模化全合成（Fig. 1b）。

（Fig. 1，来源：Nature）

全合成研究（Fig. 2）：

（Fig. 2，来源：Nature）

作者以已知化合物4和商业可得(S)-(+)-甘油醇缩丙酮为原料开展全合成研究。如Fig. 2所示，4和Rawai二烯发生不对称Diels-Alder反应，然后经还原和分子内共轭碱消除得到烯酮6，构建起C3位全碳季碳。6和5经TEMPO/NaOCl体系氧化、格氏试剂加成、DMP氧化三次转化得到烯酮7。7在三氟乙酸条件下会脱去Boc保护基，同时受位阻影响发生高选择性亚胺环化，生成所需螺环亚胺8。片段9的合成是以(S)-(+)-甘油醇缩丙酮为起始原料，经氧化、HWE烯烃化、Michael加成、氢化铝锂还原、Appel反应、炔基锂进攻碘试剂、环氧化、炔基锂进攻环氧、锆/碘化等反应得到（详见图1 in SI）。8和9通过优化出的螺环控制、高立体选择性铜介导共轭加成连接起来，再经三氟甲磺酸乙烯酯化，以70%的中等产率得到单一非对映异构体3。反应详细条件筛选见Table S1 in SI。

双炔3可以经RCAM反应发生炔烃关环，但所需Mo催化剂当量较大（12.5%），可能是受到亚胺氮的碱性影响。因此，作者将3先用Troc保护亚胺氮，再发生RCAM反应得到10，能降低Mo催化剂当量至2.0%。10在酸性条件下裂解出C4位酮羰基并脱去C10位TBS保护基，以68%的克级规模产率得到化合物11，从而构建起大环骨架。

为了构建大环骨架上的多种氧化态，11先发生金催化环化/缩酮化，通过骨架重组构建三个新环，将潜在敏感反应位点（C1氨基、C4酮羰基、C7-C8炔、C10位醇羟基）原位保护，得到化合物SI-2（见图2 in SI）。所得SI-2烯烃双键在优化出的钌催化六电子氧化条件下，克级规模转化成双酮化合物12。12先被L-selectride选择性还原C15位羰基，再被硼氢化钠还原C14位羰基得到二醇化物28（见SI）。所得二醇化物28经TEMPO/NaOCl体系选择性氧化C14位羟基，生成产物13。13粗品在Zn/AcOH中加热反应，会脱去Troc保护基，经可能的中间体14发生环-链互变异构和重组骨架，克级规模生成化合物15。15先发生烯醇硅醚化，然后经DMDO氧化和Oxone氧化，得到氧化产物16。16在乙酸酐和三乙胺条件下会发生Boekelheide类重排和乙酰化双羟基，得到产物17。17经Suzuki偶联连接上乙烯基，然后在氢氧化锂条件下选择性脱去C5位羟基乙酰基保护基，得到化合物18。18经DMP氧化和氨水水解乙酰基，转化成Portimine B (2)。2在氰基硼氢化钠条件下发生选择性还原，得到Portimine A (1)，从而实现成PA和PB的规模化全合成。相关谱图数据和分离文献一致。其中，PB最初报道的分子结构有误，其应该含有一个缩酮环系而不是半缩酮环系。

（图1 in SI，来源：Nature）

（Table S1 in SI，来源：Nature）

（Table S2 in SI，来源：Nature）

（图2 in SI，来源：Nature）

抗癌活性研究（Fig. 3-4, Extended Data Fig. 1-6）：

在完成PA和PB的规模化合成后，作者接着开展了抗癌活性研究。在Fig. 3和Extended Data Fig. 1-4中开展了多种活性研究实验，包括：1）Fig. 3a中测试了PA对20种人源和鼠源癌细胞株的抗增殖活性。结果显示，PA具有强效癌细胞抑制活性，其半抑制浓度IC50在0.55-5.6 nM（详见Extended Data Fig. 1）；2）Fig. 3b、3c中测试了六个化合物对Jurkat细胞（白血病细胞）的IC50值。结果显示，PA、PA-DA、Ph-PA具有强效抑制活性，相反ePA、ePA-DA、PB没有抑制活性。这证明PA的抗增殖活性取决于C5立体构型，且末端乙烯基不是活性表达所必须基团；3）Fig. 3d、3e中测试了四个化合物对Jurkat细胞凋亡的影响。结果显示，PA和PA-DA在低浓度下即可诱导细胞凋亡，ePA和ePA-DA不会诱导细胞凋亡；4）Extended Data Fig. 2a中，加入pan caspase抑制剂Z-VAD-FMK4会减少Jurkat细胞的死亡；5）Fig. 3f中测试了四个化合物对Jurkat细胞分裂周期的影响。结果显示，PA会诱导细胞周期阻滞（因为G1期分步增大，详见Extended Data Fig. 2b-e）；6）Fig. 3g的活性测试显示，PA对人外周血单核细胞（PBMCs）具有低细胞毒性，这证明PA对快速增殖细胞具有选择性细胞毒性；7）Fig. 3h、3i和Extended Data Fig. 4的体内活性测试显示，PA能明显抑制肿瘤增长延长生存期，且冲洗实验证实PA仅需最低30分钟的暴露时间就能确保强效细胞毒性。

（Fig. 3，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 1，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 2，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 3，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 4，来源：Nature）

最后，作者尝试确定PA的蛋白质靶点。作者首先利用TMT蛋白质组学方法，在PA能表现出细胞毒性的几种细胞株中（Jurkat细胞、HCC1806、MC38等）识别PA靶标，发现仅有60S核糖体输出蛋白NMD3满足标准（Fig. 4a, 4b和Extended Data Fig. 5a）。接着，作者通过化学沉淀法和免疫印迹法验证了这种相互作用（Fig. 4c和Extended Data Fig. 5b-d）。作者还通过细胞热转移实验（CETSA）评估了配体诱导的稳定性，进一步证实PA和NMD3之间的直接相互作用（Fig. 4d, 4e和Extended Data Fig. 5f, 5g）。此外，在NMD3水平被shRNA降低的细胞中测量了化合物诱导的细胞毒性，结果显示与对照细胞相比，缺失NMD3的Jurkat、HeLa、MC38细胞对PA的敏感性明显降低，这可以证实NMD3是PA活性所必需的（Fig. 4f, 4g和Extended Data Fig. 6a-c）。最后，作者通过Fig. 4h-j和Extended Data Fig. 6d-j的测试实验确定了PA会阻碍核糖体的组装和蛋白质的翻译，从而导致癌细胞凋亡。

（Fig. 4，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 5，来源：Nature）

（Extended Data Fig. 6，来源：Nature）

总结

总之，Phil S. Baran等课题组合作报道了portimines的规模化全合成方法，并通过细致的抗癌活性研究确定其靶点是NMD3。作者认为此研究展示了理想标准设计的全合成路线可以和强大的化学蛋白质组学方法结合，用以识别潜在治疗靶点。作者后续将进一步研究PA和NMD3的结合细节。

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