湖南大学冯欣欣、白玉罡课题组JACS：探寻胞内金黄色葡萄球菌的有效杀灭方法——抗菌剂亚细胞器定位的重要性

前沿科研成果

探寻胞内金黄色葡萄球菌的有效杀灭方法：抗菌剂亚细胞器定位的重要性

细胞内细菌病原体（Intracellular Bacterial Pathogens, IBPs）的存在是导致慢性感染和抗生素耐药性的一大元凶，其在临床上的重要性日益凸显。金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为备受关注的“ESKAPE”病原体之一，能够在被宿主细胞吞噬之后经由早期吞噬体-晚期吞噬体-溶酶体融合过程并最终停留在吞噬溶酶体中（见图1A）。在酸性的吞噬溶酶体中，S. aureus能够以休眠的状态存在，启动自身针对胞内环境的生存策略，显著减缓自身的新陈代谢，从而使得细胞本身的吞噬过程与传统抗生素对其的效力大幅降低。为了解决这些问题，研究者们通常采取的策略是提高胞内的抗生素浓度，将焦点放在提高常规抗生素在细胞内的积累量上。目前已报道的方法包括使用抗体偶联抗生素、利用多肽或纳米材料传递抗生素，以及设计具有直接穿透宿主细胞膜能力的小分子、多肽、聚合物和噬菌体等抗菌剂。这些系统大多依赖于抗菌剂在细胞质中的低效被动扩散作用，未能针对病原菌在胞内的位置进行优化——实际上，抗菌化合物在胞内的定位究竟对胞内菌杀灭有多大的重要性也是一个未知的问题（DOI：10.1021/jacs.3c09587）。

近期，湖南大学冯欣欣课题组和白玉罡课题组基于过往在抗菌寡聚物上的工作基础（Sci. Adv.2021, 7, eabc9917; Biomaterials2021, 275, 120858; Chem. Mater.2022, 34, 3670; Adv. Healthcare Mater.2022, 11, 2200546; CCS Chem.2022, 4, 3573等）合作开发了以膜-DNA双重抗菌机制为基础的寡聚胍OG系列肽类模拟物，通过结合精确胞内靶向与双重抗菌机理两方优势，达到了高效清除吞噬溶酶体内的S. aureus的目的。该工作不仅证实了这种策略可以最小化双亲性抗菌寡聚物（拟肽）与其他亚细胞器的相互作用，从而增强拟肽的生物相容性，还证实了抗菌化合物在胞内的定位对胞内菌杀灭的重要性，从而为未来胞内杀菌系统的开发提供了理论基础。

图1. 靶向细胞内S. aureus的膜-DNA双重抗菌机制寡聚胍的设计原则和合成步骤。（图片来源：JACS）

如图2所示，为研究OG系列寡聚胍化合物的细胞摄取能力，研究团队对OG系列化合物和万古霉素在细胞内的积累量进行了测试，并分析了OG系列化合物的积累量与结构之间的关系，筛选出了OG9结构。此外，通过对OG9的细胞内摄取机制、分子动力学模拟以及细胞成像的研究，团队进一步证实了寡聚胍OG9具有胞内高积累的特性，能够靶向溶酶体，这可能是决定其细胞内S. aureus清除能力的关键。

图2. (A) OG系列寡具胍以及万古霉素的胞内积累；(B) OG系列寡具胍细胞内积累的定量构效关系分析；(C-D）OG9的进胞机制；(E) OG9结合叶酸受体的分子动力学模拟； (F-H) OG9的细胞内定位。（图片来源：JACS）

如图3所示，为了进一步验证OG9与S. aureus在细胞内的共定位作用及其杀菌效果，该研究团队进行了荧光共聚焦和共定位分析实验，阐明了寡聚物通过靶向溶酶体、利用细胞本身的生化过程最终实现胞内S. aureus靶向的过程。研究结果表明，OG9具有广泛的靶向能力，可以作用于不同的S. aureus菌株。此外，胞内杀菌实验进一步证明，与万古霉素相比，OG9对胞内S. aureus的杀菌效果更为显著。而且，OG系列寡聚胍的细胞内积累与其杀菌活性之间存在明显的正相关关系，证实了精确的靶向和积累是决定其消除细胞内S. aureus能力的关键因素。

图3. OG9与巨噬细胞内S. aureus的共定位分析及寡聚胍的细胞内抑制活性。(A-B) OG9和胞内S. aureus的共定位；(C-D) 在OG9对S. aureus休眠菌以及持留菌的杀菌效果； (E) OG9杀灭胞内S. aureus的PI染料成像；(F-I) OG系列化合物对胞内S. aureus的杀菌效果；(J) OG系列寡聚胍的细胞内积累与杀菌活性之间的关系。（图片来源：JACS）

为了进一步确认精确的吞噬溶酶体靶向是根除细胞内S. aureus的关键，该研究团队通过荧光共聚焦实验证实了OG9与存在于细胞质中的志贺菌以及存在于细胞内沙门氏菌囊泡（SCV）的鼠伤寒沙门氏菌均无法发生共定位作用，也没有很强的抗菌效果。然而，OG9却能够与经过遗传改造后逃脱SCV并与溶酶体融合的沙门氏菌突变体（St ΔsopD）在细胞内共定位，并杀灭St ΔsopD。因此，OG9的细菌靶向是基于其吞噬体定位，而不是对IBPs的主动靶向效应。抗菌寡聚物与IBPs的细胞内共定位能力会带来优异的杀菌活性（如对S. aureus和St ΔsopD）；反之，较低的抗菌剂-IBP内共定位能力则导致了其杀菌活性的缺乏（如沙门氏菌和志贺菌）。

图4. OG9与其他细胞内细菌病原体（IBPs）的共定位分析以及OG9对其胞内的杀菌效果。（图片来源：JACS）

传统抗生素的作用机制一般是抑制细胞生长相关过程，例如抑制细胞壁、蛋白质、核酸和叶酸的合成等。然而，对于胞内细菌病原体（IBPs），由于其自身的毒力因子模块以及低代谢状态，它们对传统抗生素具有很高的耐受性。具有细菌细胞膜和DNA双重靶向机制的OG9可以很好地解决这一问题，因为其抗菌机制不依赖于细菌的生长。如图5所示，一系列的实验证明了OG9能够结合到休眠状态的S. aureus的细胞膜上，导致细胞膜表面电荷的剧烈变化和结构性损害，同时结合细菌DNA从而干扰细菌内部的正常生化过程。更为重要的是，相较于传统抗生素，这种细菌细胞膜-DNA双靶向抗菌机理几乎不产生耐药性。此外，流式细胞术结果表明OG9处理的细菌细胞中生成了ROS，并且荧光共聚焦实验证明OG9仅在细胞内S. aureus处触发了ROS的产生，而在其他亚细胞区域如线粒体中等并未观察到ROS水平的升高，着进一步揭示了OG9的抗菌作用是高度靶向于吞噬溶酶体内的S. aureus的。

图5. OG9对细胞内S. aureus的双重靶向抗菌机制。（图片来源：JACS）

最后，为了进一步验证OG9对体内S. aureus感染的治疗效果，如图6所示，研究团队首先构建了S. aureus感染的C. elegans模型并验证了OG9的内体靶向效果。荧光共聚焦实验证明在C. elegans的肠道上皮细胞中S. aureus和OG9具有明显的共定位作用，这表明该靶向策略在活体内也是有效的。接下来，研究团队在评估OG9对小鼠的体内毒性后，利用基于胞内S. aureus的小鼠皮肤脓肿感染模型验证了OG9具有良好的活体治疗效果，并且治疗过程中OG9没有对小鼠产生明显的毒性。

图6. OG9在活体动物上展现出优异的抗菌疗效。（图片来源：JACS）

总的来说，研究团队设计了一种具有细菌细胞膜和DNA双重靶向机制的阳离子寡聚物OG9。该化合物能够通过内吞作用有效地进入感染了S. aureus的细胞，最终在吞噬溶酶体中与胞内S. aureus发生共定位作用，实现细胞内S. aureus的有效清除。该研究揭示了精确的亚细胞定位对于消除细胞内细菌的重要性，为今后基于定位的胞内细菌杀灭分子的设计策略提供了新的思路。这项研究成果已发表在Journal of the American Chemical Society上，第一作者是湖南农业大学园艺学院讲师白思蕾（博士毕业于湖南大学化学化工学院），共同第一作者是湖南大学化学化工学院博士生宋均凤和国防科技大学濮黄生博士。湖南大学生物学院助理教授万木阳、张春辉两位老师为本项目提供了关键技术支持。

课题组简介

冯欣欣课题组简介，湖南大学化学化工学院副教授。2009年于南京大学取得学士学位（导师：宋友老师），2009-2017年在美国伊利诺伊大学（香槟校区）攻读博士学位及进行博士后工作，2017年9月起就职于湖南大学。冯组的主要科研方向为以细菌细胞膜以及DNA为靶标的“抗耐药性”抗菌药物的开发及其化学生物学研究，在相关领域发表SCI论文40余篇，包括Sci. Adv.、JACS、PNAS、J Med Chem等。课题组主页：www.fenggroup.online。

白玉罡课题组简介，湖南大学化学化工学院教授。2009年于南京大学取得学士学位（导师：尹贵），2009-2017年在美国伊利诺伊大学（香槟校区）攻读博士学位（导师：程建军/Steven C. Zimmerman）及进行博士后工作（Steven C. Zimmerman），2017年9月起就职于湖南大学。湖南大学白玉罡课题组主要研究功能高分子、生物大分子的的制备、组装、性质与应用，课题组的两个主要方向是：（1）基于大分子体系的活体内非天然催化系统的建立与应用；（2）抗菌、抗病毒（Antimicrobials）大分子的设计、制备与应用研究。

万木阳课题组简介，湖南大学生物学院助理教授，2015年获得湖南师范大学理学学士学位，2020年获得浙江大学细胞生物学博士学位（导师：朱永群教授），同年7月起就职于湖南大学生物学院研究方向为病原微生物感染宿主的分子机制研究以及流感病毒广谱疫苗的研发，以第一作者或共同作者在Nat. Micro.、PNAS、Science等国际期刊发表SCI论文多篇。

张春辉课题组简介，湖南大学生物学院助理教授，分别于2011、2016年在四川大学取得学士及博士学位（导师：杨胜勇教授），2016至2021年先后在美国肯塔基大学（导师：Chang-Guo Zhan教授）、耶鲁大学（导师：William L. Jorgensen教授）进行博士后工作，2021年9月起就职于湖南大学。张春辉课题组主要研究方向为计算机辅助药物设计算法开发及小分子药物研发，目前已发表SCI论文20余篇，所研发的2个新药已转让至药企，其中一个正进行一期临床试验。

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：这个工作最初的兴趣源自于对胞内病原体（尤其是金黄色葡萄球菌）的杀灭。在研究的过程里面，我们发现寡聚物能够与胞内金黄色葡萄球菌共定位，通过文献调研，我们发现其实共定位的现象在很多纳米材料中也存在，但是这一生物现象的机制和重要性是不明确的。于是我们试图以文中的寡聚物为主体对这一科学问题进行研究，即分析抗菌分子-细菌共定位是否能带来更好的靶向杀灭效果，也就是这种“胞内的药物动力学”的重要性究竟如何。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：研究中遇到的最大挑战是我们团队内部技术条件的缺乏，如寡聚物-细胞膜相互作用的解析、细胞内高精度成像、胞内病原体的的基因调控、病原体囊泡的分离。在这个工作中得到了万木阳老师和张春辉老师的支持，我们解决了一部分的问题。在后续的工作里面，我们希望能够更加深入、系统地研究胞内病原体精准靶向的科学问题，包括对不同种类的胞内病原体（如金黄色葡萄球菌、肺结核分支杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、军团菌等）的一一靶向，因此非常希望能够得到相关专家的支持与帮助！

冯欣欣、白玉罡课题组长期招收本科生、研究生、博士生、博士后、科研助理，欢迎来信咨询！对博士生、博士后、科研助理的招生/招聘要求：

冯欣欣课题组

以下两个条件中，至少满足一个：

（A）可以熟练进行基础的有机合成操作（基本无水无氧操作、柱层析、TLC、重结晶、蒸馏等），可以独立设计（参考相关文献）不是太复杂的分子的合成路线。（注意：基础合成操作能力与经验即可，不要求合成方法学、全合成等hardcore organic chemistry类型的研究背景）

（B）熟悉细菌化学生物学，硕士期间从事细菌或者病原体相关的科研工作，熟悉细菌的基因插入、基因敲除等。

3. 具有以下科研经历或者操作经验者将优先考虑：

(a) 熟悉质粒相关知识与操作，熟悉蛋白的表达（E. coli）、纯化操作，有定向进化工作经验者优先；

(b) 具有小鼠实验经验，熟悉病原体感染小鼠模型者优先；

(c) 对抗菌化合物、抗菌材料和相关抗菌机理有深入的了解，有相关科研工作经验者优先。

白玉罡课题组

1. 可以熟练进行基础的有机合成操作（基本无水无氧操作、柱层析、TLC、重结晶、蒸馏等），可以独立设计（参考相关文献）不是太复杂的分子的合成路线。（注意：基础合成操作能力与经验即可，不要求合成方法学、全合成等hardcore organic chemistry类型的研究背景）

2. 以下条件满足至少一条：

(a) 熟悉质粒相关知识与操作，熟悉蛋白的表达（e. coli）、纯化操作，有定向进化工作经验者优先；

(b) 熟悉常见的高分子合成化学，如ATRP, RAFT, ROMP, 各种开环聚合、缩合聚合等，对高分子功能材料的设计与应用有足够了解；

(c) 对功能DNA材料有较高的熟悉程度，了解功能dna序列的设计、应用，对SNA的设计、合成与应用有经验者优先；

(d) 对NCA聚合领域有较好的熟悉程度，了解NCA和多肽的合成、修饰、应用；

(e) 对抗菌化合物、抗生素、抗菌材料（纯粹的PDT类除外）和相关抗菌机理有深入的了解，具有微生物学相关学习背景或研究背景。

对（a）-（e）方向特别熟悉的，可以适当降低对第2点的要求。

邀稿

今天，科技元素在经济生活中日益受到重视，中国迎来“科学技术爆发的节点”。科技进步的背后是无数科学家的耕耘。在追求创新驱动的大背景下，化学领域国际合作加强，学成归国人员在研发领域的影响日益突出，国内涌现出众多优秀课题组。为此，CBG资讯推出“人物与科研”栏目，走近国内颇具代表性的课题组，关注研究、倾听故事、记录风采、发掘精神。来稿请联系C菌微信号：chembeango101。

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