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JACS: IGF2-融合溶酶体靶向嵌合体用于降解细胞外和膜蛋白

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导读

近日,新加坡国立大学姚少钦、浙江工业大学葛璟燕和大连理工大学都书博团队共同报道了一系列与胰岛素样生长因子2(IGF2)融合的重组蛋白iLYTACs。这些蛋白可以在几天内通过标准的克隆和细菌表达方法方便且高产率的获得。I型iLYTAC和II型iLYTAC均可有效的通过溶酶体靶向和降解各种细胞外和膜结合蛋白。iLYTAC代表了一种方便和选择性靶向蛋白质降解的通用和模块化策略,从而扩大了当前LYTAC和相关技术的潜在应用。文章链接DOI:10.1021/jacs.3c08886

正文

人类中超过30%的编码蛋白质的基因表达细胞外或细胞表面蛋白质。其中许多蛋白在各种病理生理条件下发挥着关键作用。近年来,靶向蛋白降解(TPD)技术已成为靶向传统不可成药蛋白的新型高效治疗方式。然而,大多数TPD相关策略,包括PROTAC、分子胶和AUTAC等,只能降解胞质蛋白或具有胞质结构域的膜蛋白。在此,作者报道了iLYTACs,并通过一系列实验证实了iLYTAC可以用于扩展当前LYTAC和相关技术的潜在应用。下载化学加APP到你手机,更加方便,更多收获。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

IGF2R结构域11特异性结合IGF2。结合后,IGF2–IGF2R复合物经历细胞运输进入溶酶体,最终导致IGF2降解。作者首先验证了IGF2的这种特殊性质可以被用作一种有效的溶酶体靶向受体(LTR)配体,以实现细胞外和膜蛋白的广泛有效的溶酶体递送和降解(图1A、B和S1)。在概念验证实验中,作者证实了细胞外生物素结合蛋白NeutrAvidin protein DyLight 650/488(NA650/NA488,图1C和S2)的成功细胞摄取和溶酶体递送。细胞的蛋白质组裂解物的凝胶内荧光扫描分析显示,IGF2介导的NA488摄取与时间相关,显著摄取在2小时开始发生,并持续24小时(图S2C),且在洗出后2小时明显观察到NA488带的荧光强度显著降低,表明NA488的溶酶体降解成功。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

随后,作者试图将基于IGF2的iLYTAC建立为一个通用、方便和模块化的平台(图1D)。I型iLYTACs是IGF2与POI结合物或纳米体融合的产物,即IGF2-TB。II型iLYTAC(也称为IGF2-Z)是免疫球蛋白G(IgG)的Z结构域与IGF2融合,从而能够融合大多数市售mAb(图1E)。作者总共构建了四种I型iLYTACs,即IGF2-AfEGFR、IGF2-AfSyn、IGF2-NbGFP和IGF2-NbPDL1。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

接下来,作者进行了BLI实验,确证了iLYTACs中的IGF2仍保持对IGF2R的结合活性(图2E和S7)。用LysoTracker Green对IGF2-TB处理的细胞进行的进一步共定位实验显示,大多数内化的IGF2-TB的溶酶体定位成功(图2I和S8C)。作者在K562和HeLa细胞中用IGF2-AfEGFR进行了竞争摄取测定(图S9A),进一步验证了IGF2/IGF2R辅助摄取IGF2-TB。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

接下来,作者确证了iLYTACs能够介导疾病相关的细胞外蛋白和膜蛋白的溶酶体降解(图3A–D和S10A,B)。此外,添加了溶酶体抑制剂Baf和氯喹CQ后显著抑制了EGFR降解,进一步证实了溶酶体降解机制(图3E)。作者进一步评估了IGF2-AfEGFR如何影响EGFR的下游信号传导。急性EGF刺激(100 ng/mL,20分钟)没有降低EGFR水平,但显著增强了磷酸化(图3F,泳道2)。单独用IGF2或AfEGFR预处理没有改变EGF刺激后EGFR的Y1068的磷酸化状态(图3F,泳道3和4)。然而,作者观察到pEGFR表达在IGF2-AfEGFR处理的细胞中显著减少(图3F,泳道5),这表明与西妥昔单抗(Cet)/AfEGFR结合相比,IGF2-AfEGFR去除EGFR在抑制下游激酶信号传导方面更有效。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

为了进一步验证iLYTACs的普适性和灵活性,作者接下来设计并得到了靶向PD-L1的iLYTACs IGF2-NbPDL1和IGF2-3-NbPDL1。观察到了与IGF2-AfEGFR类似的效果(图3G、H、S10D和S8D)。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

随后,作者进一步评估了iLYTAC介导的细胞外蛋白降解。GFP和α-Syn被用作靶向蛋白;相应的iLYTAC IGF2-NbGFP (图 4A,4B)和IGF2-AfSyn(图4C,D)均对GFP和α-Syn表现出降解能力。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

随后,为了探索在II型iLYTAC(或IGF2-Z)的基础上开发通用降解平台的可能性,作者使用类似于生产I型iLYTACs的方法将IGF2-Z在大肠杆菌中表达、纯化并表征(图5A和S3–S8)。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

接下来,作者评估了IGF2-Z与Cet联合是否可以降解内源性EGFR(图5E和S13A,B);WB分析显示,与Cet和IGF2-Z共同孵育的HeLa细胞内的EGFR水平以剂量和时间依赖的方式显著降低,在用摩尔比1:10 Cet/IGF2-Z 24小时孵育处理的细胞中观察到有效的EGFR降解。IGF2和Z结构域之间的连接体的长度不影响降解效率(图S13C)。这种降解被溶酶体抑制剂抑制(图5F)。免疫荧光和CLSM显示,在用Cet+IGF2-Z处理的细胞中,膜结合的EGFR信号成功地输送到主要的溶酶体(图5G)。与用IGF2-AfEGFR处理细胞的I型iLYTAC相比(图3B–F),作者观察到在EGF刺激后,用Cet+IGF2-Z处理的HeLa细胞中pEGFR和pAKT(S473;EGFR的下游靶标)的水平更显著地降低(图5H)。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

为了进一步验证IGF2-Z的普适性,作者研究了IGF2-Z降解CD20的能力。结果发现,用IGF2-Z+Ritu处理Raji细胞后,比单独用Ritu或IGF2-Z处理的细胞的CD20水平低得多(图5I和S13E)。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

随后,作者选择IGF2-Z来评估其在小鼠中的药代动力学和生物分布。静脉注射Cy5标记的IGF2-Z、Cet和Cy5(图S14A)。基于处理小鼠尾血中荧光强度的清除率显示,仅使用Cy5染料的清除率最快,其次是IGF2-Z,最后是Cet(图6A),这与分子大小影响药代动力学的已知现象一致。主要器官的离体荧光成像也显示出类似的清除趋势(图S14B–D);IGF2-Z与Cet的复合物形成并没有显著影响IGF2-Z的清除率,这可能是由于血液中IgG水平高得多。此外,在IGF2-Z或Cet-5-h处理的小鼠中,观察到肝脏的摄取最高。5小时时在肾脏中检测到强烈信号,表明IGF2-Z正在迅速从血液循环中清除(图6B和S14D)。

(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)

随后,作者使用HeLa细胞异种移植的Balb/c裸鼠,在体内评估iLYTACs的治疗潜力。结果表明,用IGF2-Z+Cet治疗的小鼠的肿瘤体积和重量下降了~50%,而用IGF2-AfEGFR治疗的小鼠肿瘤体积和体重下降水平略低(图6E和F)。WB结果也表明通过使用iLYTAC,体内EGFR成功降解(图6G/H)。

总结

新加坡国立大学姚少钦、浙江工业大学葛璟燕和大连理工大学都书博团队共同首次报道了一种用于降解细胞外蛋白和膜蛋白的重组嵌合IGF2融合蛋白iLYTACs。iLYTACs蛋白可以通过大肠杆菌以简单高产的方式获得,在治疗癌症和神经退行性疾病均具有极大的潜力。iLYTACs代表了一种方便地选择性靶向细胞外蛋白质和膜蛋白降解的通用和模块化策略,扩大了当前LYTACs和相关技术的潜在应用。

文献详情:

Bei Zhang,Rajeev Kungur Brahma,Liquan Zhu,Jiayi Feng,Shiqi Hu , Linghui Qian,Shubo Du * ,Shaoqin Yao * ,Jingyan Ge * . Insulin-like Growth Factor 2 (IGF2)-Fused Lysosomal Targeting Chimeras for Degradation of Extracellular and Membrane Proteins. J Am Chem Soc .2023, https://doi.org/ 10.1021/jacs.3c08886

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