南加大团队揭示全新snoRNA-tRNA互作网络，捕获7000多种snoRNA靶点

在 20 世纪 60 年代，核酸测序技术尚未面世，那时人们通过凝胶电泳、以及化学分析等方法，发现不少富含尿苷的非编码 RNA，并将它们命名为 URNA，比如 U1、U2、U3 等。

20 世纪 80 年代，人们发现其中一些小核 RNA（snRNA），比如 U1、U2、U4、U5 和 U6 可以催化 mRNA 的剪接。

而另一些小核 RNA 比如 U3、U8、U13、U14 等，则可以结合 rRNA/snRNA，并能诱导后者的加工和修饰。这些小核 RNA 也被称为 snoRNA 和 scaRNA（下称 snoRNA）。

20 世纪 90 年代起，随着基因组测序和生物信息学逐渐成为研究生物学的核心技术，人们意识到在人类基因组中存在着一大类 snoRNA，它的种类超过 2000 种。

一部分 snoRNA 通过碱基配对，能和靶标 RNA 发生结合，并能引导靶标 RNA 的化学修饰，比如 2'-O 核糖甲基化和假尿苷异构化。而大多数 snoRNA 并不拥有已知的靶标，因此也被称为“孤儿 RNA”。

近年来，学界开始将 snoRNA 与各种生理状态和疾病联系起来。比如：

印记 snoRNA 簇“孤儿 SNORD116”的缺失，会引起普拉德-威利综合症（Prader-Willi Syndrome）的发生。该位点有一种独特的表观遗传现象——遗传印记。其中，每个基因的两个拷贝，仅仅表达父本或母本。

印记簇 D113/D114 的突变，则会导致另一种神经发育疾病 Kagami-Ogata 综合症的发生。

SNORD118（U8）的突变，会导致伴有钙化和囊肿的白质脑病（LCC，Leukoencephalopathy with Calcifications and Cysts）的发生。

SNORA31 的变异，则会损害皮质神经元对于单纯疱疹病毒的内在免疫力，进而引发单纯疱疹脑炎。

此外，也有研究将 snoRNA 与癌症、代谢疾病、长寿等联系起来。过去三十年间，“孤儿 snoRNA”的靶标、以及它们在发育与疾病中的作用机制一直悬而未决。

十几年前，当美国南加大教授在读博的时候，就开始关注“孤儿 snoRNA”的问题。

图 | 鲁志鹏（来源：）

长期以来，针对 RNA 结构和相互作用的研究，严重依赖于物理学方法比如核磁共振、X 射线衍射和冷冻电镜。这些传统方法并不适用于绝大多数细胞内的 RNA，因为它们的构象过于复杂多变。

大概在十年前，想出一种新策略：使用化学交联和临近连接的办法，抓住细胞内空间临近的 RNA 片段。

理论上来说，这种空间距离的测量可以完全重建细胞内 RNA 的结构和相互作用。“想出这种策略之后我非常激动，我相信这一方法如果成功的话，将会开创一个新的领域，并解决很多 RNA 生物学的关键问题。”说。

后来，他一边做博士的课题，一边暗地里尝试上述想法。彼时，他的博士导师也允许他自由探索。

博士毕业之后，带着自己开创的课题，来到斯坦福大学从事博后研究。后来，他很快就实现了这个想法，并把相关技术命名为 PARIS（Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures）。

由于这一方法的英文简称和法国的首都巴黎同名，因此他和同事为相关论文专门设计一个别具一格的封面图，即使用 RNA 二级结构来描绘巴黎埃菲尔铁塔。

（来源：Cell）

在 2016 年这篇论文中，他和同事发现通过 snoRNA U8 结合 rRNA，可以指导 rRNA 的加工，从而揭示 LCC 这种神经退行性疾病的分子机制。

后来，这篇论文不仅登上 Cell 封面，还登上 Cell 2016 年论文精选集的封面（Best of Cell 2016）。

很多其他期刊比如 Nature Methods、Nature Chemical Biology、Molecular Cell、Trends in Biochemical Sciences 等也都专门发表评论。

加入南加州大学成立独立实验室之后，重新设计了上述流程中的几乎所有步骤，并迭代出第二版 PARIS2，将效率提升了 4000 多倍[2]。

他说：“虽然我在 2018 年才在南加州大学独立建组，但在某种程度上我在 2013 年博士毕业之前就已经独立。我经常告诉学生，只要你敢想敢干，任何人都可以开创新领域，我也非常支持他们尝试全新的想法。”

同样在 2018 年，团队的第一位博士后开始继续研究“孤儿 snoRNA”的问题。

一开始他们专注于相关方法的开发，期间发表了一篇关于 PARIS2 的论文[2]、以及一篇关于 CRSSANT 计算方法的论文[3]。

大约三四年前，他们终于在方法学上做好准备，开始正式解决“孤儿 snoRNA”的问题。

但是，哪怕使用效率较高的 PARIS2 方法，课题组也耗时一年多之久，才从多个细胞系之中获得足够的测序覆盖率。

期间，他们使用多种的细胞类型，来增加发现更多 snoRNA 靶点的机会。 2020 年底，他们终于获得 snoRNA 与 tRNA 结合的第一个证据。

大约在同一时期，另一支课题组发表了一篇论文，该论文表明两种 snoRNA 可以与 tRNA 结合。“但是，上述论文并未进一步研究其功能。而我们的工作则对上述证据进行了独立验证。”说。

在发现 snoRNA-tRNA 的相互作用之后，他们同时探索了多个方向，并发现 snoRNA-tRNA 的互作可以调控 tRNA 修饰、tRNA 稳定性、水平和活性、蛋白质翻译、细胞生长、以及干细胞的多能性和分化。

通过本次研究他们进一步扩展了对于 snoRNA 靶点和功能的理解[1]。而使用高度优化的新一代方法 PARIS2，他们发现 7000 多个 snoRNA 靶标，包括各种类型的非编码 RNA，其中大约 1000 个涉及到 snoRNA-tRNA 的相互作用。

接着，在多种方法的帮助之下，课题组进一步将本次新发现的 snoRNA 靶点加以验证。

其中一部分 snoRNA 靶点在很多物种中呈现高度保守的特点，尽管它们与真核生物已经分开超过 15 亿年，但是它们甚至存在于一些古菌类群中。

作为翻译机器的核心零件，tRNA 的种类、数量和化学修饰状态，在不同细胞、不同组织器官和不同发育时期均会受到严格调控，从而直接影响蛋白质的表达、代谢、以及生物的生长发育过程。

在“细胞经济学”之中，对于 tRNA 供应和密码子使用来说，这种供需之间的动态平衡，是一种翻译优化方面的基本原则。然而，对于这种平衡的调节机制和功能，人们依旧不清楚。

而该团队发现：snoRNA-tRNA 的相互作用网络，控制着多种的 tRNA 修饰，包括 tRNA 2'-O-甲基化以及很多其他修饰。

snoRNA 及其结合的 2'-O-甲基转移酶 FBL 的缺失，会诱导产生一大类新的调节性 RNA-tRNA 片段。

而 CRISPR 敲除 snoRNA D97/D133 家族之后，会显著降低 tRNA 的活性和水平，包括参与延伸过程的（e）Met-CAU，进而改变转录翻译过程之中密码子的识别。

HEK293 细胞中的 D97/D133 单敲除和双敲除，则会抑制富含甲硫氨酸（Met）等增殖相关基因的表达，不过也会促进 Met 含量较少的基因的表达。

更有意思的是，snoRNA-tRNA 修饰网络的起源并非偶然，可能来源于生命对氧化应激的防卫，这也是一个绝大多数物种进化中所必须面对的难题。

蛋白质中的甲硫氨酸（methionine），是少数几种在氧化之后可以原位修复的氨基酸。这一特性会被所有物种用于保护蛋白质免受氧化损伤，类似于军事装备中所常用的“反应装甲”，或者 X 战警的金刚狼一样进行“自愈”。

长寿命的或者接近活性氧的蛋白质，往往和细胞生长增殖相关，并会使用更多的甲硫氨酸。而调控发育的蛋白质寿命一般较短，相对来说含有更少的甲硫氨酸。

这就导致甲硫氨酸所对应的 tRNA（eMet-tRNA），成为调控生长与发育的关键。而任何影响 eMet-tRNA 的机制，都会直接影响这两个往往互相对立的生命事件。

图 | snoRNA 基本原理以及 PARIS2 捕获的部分 snoRNA-tRNA 相互作用网络（来源：资料图）

该团队还发现在小鼠胚胎干细胞发育模型中，snoRNA D97/D133 的敲低和敲除，会促使其倾向分化为中胚层和内胚层（例如心肌细胞）。

而这对于胚胎干细胞的多能性并无影响，甚至会产生增强多能性的趋势。这一发现也与人类细胞中促进发育相关基因的表达机制一致。

同时，对于心脏损伤与疾病的治疗，本次研究也能带来重要的启示。通过调控 snoRNA 的活性，可以快速制造成熟的心肌细胞，以便加快在再生医学方面的应用。

总而言之，本次研究首次揭示一个全新的 snoRNA-tRNA 互作网络，阐述了 snoRNA 控制 tRNA 修饰、稳定性、密码子偏好、翻译效率、以及干细胞发育的机制。

同时，这项研究涵盖了多个主题，从新技术开发、到 snoRNA 靶标的发现、多种类型的验证、在人和老鼠胚胎干细胞中的功能分析、以及 tRNA 加工和翻译调控的机制研究等。

图 | 敲除 D133 既增强干细胞多能性又加速其分化（来源：资料图）

最终，相关论文以《snoRNA-tRNA 修饰网络控制密码子偏倚的细胞状态》（）为题发在 PNAS[1]。

（现天津医科大学教授）、南加州大学博士后李孔潘与白建慧是共同一作，担任通讯作者。

图 | 相关论文（来源：PNAS）

表示：“在科研之外，本次 PNAS 论文的作者们也在‘人类遗传学’方面也取得了很多成就。在过去五年里，我的实验室成员总共生了四个孩子。”

而在目前，课题组正在人诱导多能干细胞之中，测试 D97/D133 snoRNA 的功能，相信快速产生人诱导多能干细胞衍生的成熟心肌细胞，将为治疗人类心脏损伤带来帮助。

而全局性 snoRNA-tRNA 互作网络的发现表明：除了 D97/D133 之外，还有更多 snoRNA 参与 tRNA 的调节，继而参与各种生理状态下的选择性翻译调节。

该团队相信对该网络进行更深入的机制研究，将能揭示更多关于干细胞功能和动物发育的调节因子。预计这些新的 snoRNA 调节因子将成为重要的治疗靶点，其影响范围将远远超出再生医学领域。

另据悉，人类基因组编码 2000 多种 snoRNA，其中许多在真核生物甚至古细菌中都呈现出高度保守的特点。超过 7000 种新 snoRNA 靶标的发现、以及它们在 tRNA 代谢和发育中的作用，开启了无限的可能性。

对于 snoRNA 引导的 tRNA 修饰的机制人们尚不清楚，例如碱基配对之外的靶标是如何选择的、以及在不同的生物背景下修饰水平是如何调节的。

对于 snoRNA 引导的 tRNA 修饰，它们如何影响其他 tRNA 修饰和 tRNA 稳定性？snoRNA 和相关修饰酶丢失后 tRNA 片段的功能是什么？对于低修饰的 tRNA，它们如何影响翻译？哪些 mRNA 的翻译水平负责干细胞中观察到的表型？

除了研究这些问题之外，团队也在考虑一些更加宏观的问题。他说：“我们的长期目标是里解所有 snoRNA 的功能和机制。

尽管我们发现了许多不同类型的 RNA 靶标，但目前对 snoRNA 靶标的描述仍然有限。”

当然，很有可能还有更多的 snoRNA 靶标等待挖掘。“因此一个特别有趣的方向是研究 snoRNA 与遗传疾病的联系。尽管我们已经发现 LCC 中 U8 突变的影响，但遗传性疾病中其他 snoRNA 的靶标仍然未知。”说。

此外，由于外显子组测序、SNP 作图的范围有限，人类遗传学检测出的导致疾病的非编码变异很少。因此有充分的理由相信大量的 snoRNA 与未知的人类遗传有关。找到这样的联系不仅可以解开医学之谜，还可以带来新的治疗方法。

当前，RNA 生物学的发展正处于一个非常激动人心的时代，特别是靶向 RNA 治疗备受欢迎。2023 年，研究新冠病毒 mRNA 疫苗的两位科学家获得了诺贝尔奖。

事实上，过去几年间该领域还取得了许多令人兴奋的进展，包括靶向 RNA 针对多种人类疾病的反义寡核苷酸和小分子药物。

几乎所有大型制药公司都建立了 RNA 医学项目，许多顶尖大学和研究机构都很支持 RNA 医学计划。

“因此我们很高兴自己的工作能为 RNA 医学的发展做出贡献。我们所开发的独特工具，为解决棘手的 RNA 生物学问题和以 RNA 为靶点的药物开发奠定了坚实的基础。”说。

几年前，该课题组开启了和公司的合作，合作目标旨在开发能用于治疗 X 连锁遗传疾病的 RNA 靶向药物。目前，团队也正在揭示针对 RNA 病毒感染和神经发育障碍等疾病的新型 RNA 靶点。

参考资料：

1.Zhang, M., Li, K., Bai, J., Van Damme, R., Zhang, W., Alba, M., ... & Lu, Z. （2023）. A snoRNA–tRNA modification network governs codon-biased cellular states.Proceedings of the National Academy of Sciences, 120（41）, e2312126120.

2.Zhang et al. 2021, Nature Communications

3.Zhang et al. 2022 Genome Research，CRSSANT

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