抗非洲猪瘟病毒P72关键环结构单克隆抗体的制备及鉴定

非洲猪瘟(ASF)是由感染非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、强毒、高致命性传染病，致死率为100%。目前，基于主要衣壳蛋白P72已鉴定出24种ASFV基因型。ASFV可通过软蜱或直接接触感染猪及其产品传播，并且ASFV在环境中持续存在。自2018年首次发现中国养猪业以来，中国养猪业遭受了严重的经济损失。非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种传染性和致命性极强的病毒性疾病。一级结构蛋白P72表面的4个突出的环状结构被认为是关键的保护性表位。

在这项研究中，ER1-4蛋白被插入到乙型肝炎病毒核心颗粒(hepatitis B virus core particles, HBc)的MIR中，使它们能够自组装成纳米颗粒，同时保持环路结构的自然构象，增强其免疫原性。用4种纯化的重组ER1-4蛋白免疫小鼠，筛选p72特异性单克隆抗体，用于鉴定抗原表位。此外，具有有效中和特性的抗原表位可用于疫苗的研制。本研究为阐明p72表位的功能，进一步开展新型ASFV疫苗的研究提供了参考。

图1 重组ER1 VLP、ER2 VLP、ER3 VLP和ER4 VLP的设计与表达

本研究表达并纯化了ER1、ER2、ER3和ER4 4个VLPs，经SDS-PAGE、Western blot和DLS分析鉴定，成功构建了4个VLPs。其粒径均与预期粒径一致。基于ER1-4蛋白的纳米粒可形成高度稳定的结构，有助于准确显示ER1-4在环结构中，并提高其免疫原性。筛选出6株抗er2和4株抗er4高亲和力抗P72单克隆抗体，经Western blot、Dot-blot和IFA鉴定，10株单克隆抗体均能识别P72蛋白。IPMA结果表明，10株mab均能与ASFV SY18株特异性结合。至关重要的是，单克隆抗体4G8对病毒的感染具有抑制作用，其抑制作用的机制仍有待研究，但为ASFV的控制提供了重要的参考。上述结果表明，这些单克隆抗体具有良好的特异性和生物学活性。

图2 鉴定单克隆抗体与P72和ASFV的反应性（A）间接免疫荧光测定（IFA）

图3 中和单克隆抗体

所获得的10株单克隆抗体均能与P72蛋白和ASFV发生反应，效价达1∶204800。P72蛋白第250 ~ 274、279 ~ 299和507 ~ 517位氨基酸为线性表位，且高度保守。单克隆抗体4G8对ASFV阳性血清的抑制率最高，为84%。重要的是，中和实验表明，mAb 4G8具有67%的抑制率，表明其相应的表位是ASFV疫苗的潜在候选表位。综上所述，本研究构建了具有高免疫原性的ASFV P72关键环纳米粒，能够诱导高效单克隆抗体的产生，并阐明其表位信息，为ASFV的诊断和预防提供了参考。

综上所述，本研究成功制备了10株高滴度ASFV P72蛋白单克隆抗体，均具有良好的特异性和生物学活性。进一步确定P72线性表位的精确定位，并对筛选得到的P72单克隆抗体在ASFV诊断中的有效性进行探讨。6株抗er2单克隆抗体对ASFV阳性血清均有阻断作用，其中mAb 4G8株对病毒感染的敏感性和中和作用最高，可用于建立ASFV的后续诊断方法，并为研究ASFV的中和机制提供参考。这将有助于对ASFV P72蛋白结构和功能的研究，以及抗原表位的分析和精确定位，为阐明P72蛋白的生物学特性提供有力工具，为ASFV疫苗的设计提供思路。

来源：TCSG5公众号

编辑：Jo