启衡星哺乳动物/植物通用型rRNA去除试剂盒——助力circRNA的研究

环状RNA（circRNA）是一类单链、共价闭合的RNA分子。在从病毒到动植物中普遍存在。与传统的线性mRNA 不同，circRNA 分子中不存在 5' cap 和 3' poly-A 尾。相反，分子两端之间的反向连接形成了环状结构，使其不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。CircRNA 具有多种生物学功能，包括 充当转录调节因、microRNA 海绵、RNA 结合蛋白 (RBP) 海绵，通过与前 mRNA 剪接竞争的基因调控，以及外显子-内含子环状 RNA 的亲本基因调控。这些典型特征使其在疾病研究中的应用备受关注，特别是作为癌症诊断的潜在生物标志物。

Jeck, W.R., Sorrentino, J.A., Wang, K., Slevin, M.K., Burd, C.E., Liu, J., Marzluff, W.F., and Sharpless, N.E. (2013). Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA 19, 141–157.

CircRNA的形成

大规模的RNA分析表明，大约75%的人类基因组被转录成RNA，并产生数百万的RNA转录本。单个外显子的保留或跳过可以从一个pre-mRNA产生多个不同的mRNA，称为选择性剪接。当一个外显子的3'端(剪接供体位点)与同一外显子的5'端(单外显子环状RNA)或上游外显子(多外显子环状RNA)连接时，共价闭合外显子环状RNA就形成了。2013年，Jeck等人提出了circRNA形成的两种模型:套索驱动的环状化和内含子对驱动的环状化。在绳索驱动的成环中(图1A)，circRNA由剪接过程中产生的绳索中间产物形成。进一步的内部剪接反应或套链的脱支可导致几种不同的环状RNA转录本：仅来自外显子的circRNA(通常称为circRNA)、外显子-内含子circRNA (EIciRNAs)、和内含子circRNA (ciRNAs)(图1A)。

内含子对驱动的成环是基于侧翼内含子的杂交，这使得两个剪接位点接近(图1B)。在许多情况下，侧翼区域内的互补序列(例如ALU重复元件)促进内含子杂交，从而介导外显子成环(图1B)。除了存在ALU元素外，circRNA侧翼的内含子通常比内含子的平均长度长。已有研究发现，在后剪接过程中，一个基因位点可以通过使用不同的剪接供体和受体位点产生多个circRNA。大约50%的表达circRNA的宿主基因产生单一的circRNA亚型，而其他基因产生更多。众所周知，Ttn基因能产生至少38种不同的circRNA。一般来说，较长的线性基因与较高数量的circRNA亚型相关。

CircRNA研究流程：

circRNA 研究的快速增长归功于 RNA-seq技术的快速发展。在circRNA 测序流程中，从细胞或组织中提取的total RNA经过质检后，需要对total RNA 核糖体RNA进行去除处理（启衡星动物、植物通用型核糖体RNA去除试剂盒可以提高最佳的解决方案），然后，再用RNase R将线性RNA消化。链特异性文库的构建然后进行测序及数据分析（图2）。

案例分享

案例分享一：赵方庆团队揭示circRNA促进相的分离调控肿瘤发展分子机制

赵方庆团队的研究报道了circRNA circVAMP3通过促进CAPRIN1蛋白相分离，在细胞内形成应激颗粒 （stress granules） 以阻止c-Myc mRNA的翻译，进而抑制肝细胞性肝癌 （HCC） 的发生发展。该工作首次证实了环状RNA可以通过发挥分子骨架的功能促进相分离形成，从而调控肿瘤的增殖与迁移过程，为恶性肿瘤的研究提供了新的分子标志物和治疗靶点。

首先，该团队通过对20对肝癌及癌旁样本的RNA-seq数据进行挖掘，筛选到了在肝癌中表达显著下调且其母本基因变化不大的环状RNA——circVAMP3。circVAMP3由VAMP3基因的第3、4外显子通过反向剪接成环，具有与线性VAMP3基因截然不同的表达模式，并且与患者的预后显著相关。研究人员利用RNA干扰技术，通过体内外功能实验证明了circVAMP3具有抑制HCC细胞增殖和迁移的作用 （图3） 。

其次，他们对circVAMP3调控肝癌发生的机制进行了深入探究。通过对circVAMP3互作分子的筛选发现，circVAMP3可以作为分子骨架与CAPRIN1蛋白的RGG结构域结合，进而招募CAPRIN1-G3BP1复合物，导致蛋白聚集并发生相分离，在细胞中促进应激颗粒的形成。尽管先前的研究表明线性RNA可调控蛋白相分离过程，该研究首次证实了环状RNA也可通过聚集蛋白促进相分离的发生 （图4） 。

随后，研究人员进一步发现circVAMP3通过抑制c-MYC蛋白的翻译，进而抑制肝癌细胞的增殖和迁移。通过共定位研究揭示了circVAMP3通过应激颗粒抑制c-Myc翻译的分子机制 （图5）。非常有意思的是，除了在肝脏中，circVAMP3在其他组织中 （如脑、胃、结肠、脾脏、肺、甲状腺、肾脏等） 也可以广泛表达，并且其在对应的肿瘤组织中表达量均发生下调。研究人员进一步对不同组织不同肿瘤细胞系对circVAMP3进行干扰实验，发现均可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，这提示circVAMP3广泛参与了不同类型的肿瘤发生发展的普适性调控，以及其可能成为肿瘤研究共性靶标分子的潜力。

案例分享二：CircRNA分子circCAMSAP1在鼻咽癌组织中高表达，并通过SERPINH1/c-Myc反馈环路促进鼻咽癌的恶性进展

熊炜教授团队通过对鼻咽癌组织RNA-Seq数据进行深入分析，发现环状RNA circCAMSAP1在鼻咽癌组织中高表达，细胞和动物模型证实circCAMSAP1可促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移；进一步分析发现circCAMSAP1可结合并稳定分子伴侣SERPINH1mRNA的3’非翻译区，促进SERPINH1的表达，高表达的SERPINH1蛋白结合c-Myc并抑制c-Myc的泛素化降解，c-Myc则促进一系列转移和增殖相关的癌基转录，最终增强鼻咽癌细胞的增殖和侵袭转移能力。此外，c-Myc也能促进CAMSAP1基因的转录，并通过剪接因子SRSF10促进CAMSAP1的前体RNA剪接生成circCAMSAP1，从而形成一个正反馈。

circCAMSAP1通过与SERPINH1 3'UTR结合来稳定SERPINH1的表达。SERPINH1 与 c-Myc 的结合抑制 c-Myc 的泛素化和降解，导致CAMSAP1 pre-mRNA 在 SRSF10 的作用下转录和反向剪接，对circCAMSAP1的产生形成正反馈，导致增殖、迁移和NPC入侵。