南京林业大学打造大肠杆菌-酿酒酵母共培养系统

二氢-β-紫罗兰酮是一种带有特殊香气的化合物，其被广泛应用于香精香料和食品行业。考虑到该物质的天然产出率较为低下，目前其在工业领域中的生产制造主要依赖于化学合成法。

1 月 31 日，来自南京林业大学的赵林果、卜素及其团队在早期研究的基础上，首次设计并构建了以甘油为简单碳源的大肠杆菌生产二氢-β-紫罗兰酮的完整途径。在此之后，进一步优化并建立了大肠杆菌-酿酒酵母共培养系统，实现了中间体 β-紫罗兰酮的完全转化，该系统生产二氢-β-紫罗兰酮的滴度为 27 mg/L。

研究论文De Novo Synthesis of Dihydro-β-ionone through Metabolic Engineering and Bacterium-Yeast Coculture已发表至Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

长期以来，由于二氢-β-紫罗兰酮的代谢途径尚不明确，难以针对其实现生物合成。对此，研究团队通过调查早期研究发现，月季中二氢-β-紫罗兰酮是经过酶促过程生成，这就表明在植物中有一种特定的酶可以将 β-紫罗兰酮转化为二氢-β-紫罗兰酮。

据此，研究团队鉴定了一种双键还原酶 1（DBR1），据报道该酶可以将青蒿醛转化为二氢青蒿醛，还可以将 β-紫罗兰酮转化为二氢-β-紫罗兰酮。

另一方面，β-紫罗兰酮的生物合成途径已被阐明。该化合物首先经过 β-胡萝卜素作为前体的类异戊二烯途径，随后被类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）降解。其中，CCD1、CCD4 和 CCD7 用于裂解 β-胡萝卜素的 9, 10（9′, 10′）双键生成 β-紫罗兰酮。在此之前，β-紫罗兰酮的生物生产已经在大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶氏酵母等微生物宿主中得到验证。

上述进展为二氢-β-紫罗兰酮的微生物合成提供了坚实依据。因此，研究团队尝试在大肠杆菌中构建了二氢-β-紫罗兰酮的生物合成路径。

▲图丨大肠杆菌中的二氢-β-紫罗兰酮生物合成途径设计（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

整个合成途径分为四个模块：异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）合成模块；β-胡萝卜素合成模块；CCD1 模块；以及 DBR1 模块。

该过程中，研究团队首先构建表达模块 1 和模块 2 的大肠杆菌菌株，其使用甘油作为简单碳源以生产 β-胡萝卜素，并筛选出最高产量为 98 mg/L 的菌株。在此之后，利用该菌株作为底盘细胞筛选并确定使用来自于矮牵牛的 PhCCD1 酶用于生产 β-紫罗兰酮。

在此之后，研究者针对发酵条件进行了优化，在最佳条件下获得 β-紫罗兰酮的产量为 40 mg/L。然而，尽管研究者继续针对 DBR1 模块进行了筛选和优化，但二氢-β-紫罗兰酮在大肠杆菌菌株中的合成水平仍然较低（8 mg/L），并且在培养物中检测到过量的前体 β-紫罗兰酮。

针对该现象，研究者注意到早期研究中利用酿酒酵母生产二氢-β-紫罗兰酮的转化率更高，然而经试验发现酿酒酵母的生产效果同样不佳，甚至导致酿酒酵母生长抑制。对于该结果，研究人员猜测是 β-紫罗兰酮毒性导致。

为了解决该问题，研究团队通过在酿酒酵母中构建 DBR1 模块并将其与大肠杆菌（β-紫罗兰酮生产菌株）共培养，建立了一个细菌酵母菌群。试验表明，增加酵母细胞的比例会增加二氢-β-紫罗兰酮的产量。当酿酒酵母细胞的 OD600 达到 40 时，中间体 β-紫罗兰酮被完全消耗，二氢-β-紫罗兰酮的收率达到了 27 mg/L，相比单一菌株而言产量提升至 3.4 倍。

▲图丨使用大肠杆菌-酿酒酵母共培养物生产二氢-β-紫罗兰酮（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

对于该项研究结果，研究者指出，大肠杆菌摄取 β-紫罗兰酮的能力较差，因此将 DBR1 模块引入酿酒酵母是促进 β-紫罗兰酮到二氢-β-紫罗兰酮转化的更好选择。

然而值得注意的是，该项研究仍存在问题需要进一步优化解决，例如合成途径平衡调节较差、CCD1 酶催化效率较低以及共培养系统程序较为繁琐等。不过，研究人员提示道，本次试验中利用 DBR1 介导的还原反应也可以应用于其他类型的紫罗兰酮及其衍生物，以合成脱氢产物，例如二氢-α-紫罗兰酮和二氢-γ-紫罗兰酮，这两种产品也是高价值香料。

总体而言，该项研究成功应用代谢工程在大肠杆菌中实现了二氢-β-紫罗兰酮的从头合成，并且利用大肠杆菌-酿酒酵母共培养系统以提高其产量。该方法将有助于实现紫罗兰酮系列产品的生产与制造。

素材来源官方媒体/网络新闻

免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。