Plant Journal | 广州中医药大学首次发现Nudix水解酶参与龙脑生物合成

阳春砂是我国“四大南药”之一，具有化湿开胃、温脾止泻和理气安胎的功效，临床上主要用于治疗胃肠道疾病。阳春砂主要含有挥发油、黄酮类和多糖类等生物活性成分，其中挥发油为质控成分，主要包括乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、莰烯和柠檬烯等挥发性萜类。

广州中医药大学岭南中药资源教育部重点实验室詹若挺研究员团队前期解析了阳春砂基因组，并对18个WvTPS的功能进行表征，发现催化单萜通用前体GPP环化生成BPP的关键酶WvBPPS （Frontiers in plant science, 2018; The plant journal, 2022） 。同时，还解析了海南砂基因组，并对17个WlTPS的功能进行表征，发现WlBPPS和WvBPPS表达水平的差异和BPPS串联重复基因簇的功能分化是导致阳春砂和海南砂中主要挥发性萜类差异的重要原因 （Frontiers in plant science, 2021; Plant physiology, 2023） 。此外，基于阳春砂基因组数据，鉴定了催化龙脑乙酰化生成乙酸龙脑酯的关键酶WvBAT3和WvBAT4 （Frontiers in plant science, 2022） ，以及鉴定了催化龙脑脱氢生成樟脑的关键酶WvBDH2（Plant, 2023），基本完全解析了阳春砂中主要挥发性萜类的生物合成途径。然而，目前在多种植物中鉴定了催化GPP环化生成BPP的关键酶BPPS，仅在1979年报道利用撒尔维亚粗蛋白催化BPP水解生成龙脑，但催化BPP水解的酶基因还未被鉴定。

近日，该团队在国际著名植物学期刊The Plant Journal上在线发表了题为“Nudix hydrolase WvNUDX24 is involved in borneol biosynthesis in Wurfbainia villosa”的研究论文，揭示阳春砂中Nudix水解酶WvNUDX24参与龙脑的生物合成。

根据玫瑰Nudix水解酶RhNUDX1能够水解GPP生成GP，然后在非特异磷酸酶作用下水解GP生成香叶醇，由于BPP和GPP都属于单萜二磷酸，推测Nudix水解酶可能参与BPP的水解。该研究基于阳春砂基因组和转录组数据，系统鉴定阳春砂中34个Nudix水解酶基因家族成员，并通过系统进化关系和转录组表达模式筛选可能参与BPP水解的候选WvNUDXs。体外酶活性测定表明7个候选WvNUDXs中WvNUDX20和WvNUDX24能够催化BPP水解生成BP，且能够催化GPP水解的RhNUDX1和AtNUDX1也能水解BPP生成BP。进一步相对活性比较、酶动力学和烟草瞬时表达实验表明WvNUDX24能够特异和高效的催化BPP水解生成BP，从而参与龙脑的生物合成。亚细胞定位实验表明WvNUDX24主要定位于细胞质，推测BPP在质体合成后转运到细胞质中再发生水解。综合分子对接、分子动力学模拟和定点突变实验发现四个关键氨基酸残基（R84、S96、P98和G99）对WvNUDX24的水解活性至关重要。此外，磷脂酸磷酸脂酶（Phosphatidic acid phosphatase，PAP）体外功能鉴定表明WvPAP5和WvPAP10能够催化GGPP和FPP生成单磷酸产物，但不能水解GPP、BPP和NPP。

综上，该研究证实BPP水解生成龙脑是分两步进行，即BPP→BP→龙脑，并发现催化BPP水解生成BP的关键酶WvNUDX24，而BP水解生成龙脑可能由非特异性磷酸酶催化（还有待进一步研究），可为未来通过植物代谢工程和合成生物学生产BPP相关萜类（龙脑、乙酸龙脑酯和樟脑）提供关键的基因元件。

图：阳春砂中BPP相关萜类的生物合成途径

广州中医药大学博士生杨鹏为该论文第一作者，广州中医药大学马东明研究员、杨锦芬研究员和詹若挺研究员为该论文的通讯作者。湖南医药学院黄雪霜教授和广州中医药大学硕士生陈远霞和王甜甜也参与了该项研究。该研究得到了国家自然科学基金、广东省乡村振兴战略专项和中药合成生物学研究湖南省重点实验室开放课题等项目的资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.16669