上海
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作者：Jerry
导读：单细胞全基因组测序方法在过去十年中有了很大的改进。然而，等位基因缺失，即无法在单个二倍体细胞中同时检测到两个等位基因，在很大程度上限制了这些方法的应用，特别是在医学应用方面。
2024年3月5日，北京大学汤富酬团队在期刊《Cell Discovery》发表题为“Mapping crossover events of mouse meiotic recombination by restriction fragment ligationbased Refresh-seq”的研究论文，该研究基于第三代测序(TGS)平台开发了一种新的单细胞全基因组测序方法，名为Refresh-seq(限制性片段连接型基因组扩增和TGS)。
https://www.nature.com/articles/s41421-023-00638-9
研究背景
01
多细胞生物是由单个细胞组成的，遗传信息以单个染色体的形式存在于每个细胞中。单细胞全基因组测序技术的发展使人们能够在单个细胞中扩增和测序二倍体基因组，以研究细胞群体内的遗传异质性，包括单核苷酸变异(SNVs)、拷贝数变异(CNVs)和结构变异(SVs)。基于新一代测序(NGS)平台的多种单细胞基因组测序技术已经被开发出来，如简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(DOPPCR)、多次位移扩增(MDA)、多次退火和基于环的扩增循环(MALBAC)、乳液WGA (eWGA)、转座子插入线性扩增(LIANTI)、初级模板定向扩增(PTA)和互补链多路末端标记扩增(META-CS)。虽然由于NGS平台的高精度，这些技术在CNVs和SNVs的检测方面具有强大的功能，但受限于短的读长，因此在SNVs的检测方面性能较差。SVs包括缺失、插入、重复、倒置和易位，这是许多人类疾病的重要遗传变异类别。因此，在单细胞分辨率下研究SVs是至关重要的。
基于第三代测序(TGS，也称为单分子测序)平台，近年来开发了转座子插入扩增长片段的单分子实时测序(SMOOTH-seq)，利用低密度Tn5转座酶随机片段单个细胞的基因组DNA，实现相对均匀的基因组扩增。除了CNVs和SNVs外，该方法还能有效地检测出结构变异。然而，二倍体细胞中两种等位基因的有限覆盖使得其在杂合单核苷酸多态性(hetSNPs)检测中具有很高的假阴性率。
研究进展
02
研究人员首次将限制性内切酶切割和连接策略与TGS平台相结合进行单细胞基因组测序，并开发了一种单细胞长读取基因组测序技术Refresh-seq。与SMOOTH-seq相比，Refresh-seq提高了基因组覆盖率和一致性。它提高了二倍体细胞两个等位基因的恢复率，即使在很浅的测序深度下，对植入前遗传诊断等医学应用具有巨大的潜力。该方法易于实现，许多样本可以手动处理，而不需要复杂的自动化。它还可以根据使用的限制性内切酶进行调整，以满足不同的需求。Refresh-seq基于TGS平台，可以有效地检测变异结构中的SV和重复元素。当然Refresh-seq也有局限性。由于连接反应的效率，扩增子的长度仅为2-3 kb，远远短于SMOOTH-seq的扩增子长度约为6 kb。因此，由于其扩增子的长度范围，Refresh-seq不能捕获非常长的插入事件。
Refresh-seq的库构建可以在一天内完成，单管版本的库构建成本为3.6美元/细胞，多管版本的库构建成本为2美元/细胞。如果将Refresh-seq与能够进行纳米升分配的微流控生物处理器相结合，成本甚至可以更低。微流控Refresh-seq在基因组覆盖方面也可能有更好的表现，因为以10 pg基因组DNA开始的大样本在约1倍测序深度下只能达到约9%的覆盖率，而对单个HG001细胞进行Refresh-seq，其库构建量为大样本的1/10，却能达到约21.4%的基因组覆盖率。微流控Refresh-seq体积小得多(试剂体积少500- 1000倍)，可能会在更大程度上提高基因组DNA的相对浓度，提高连接效率和PCR效率。
Refresh-seq原理图（图源自Cell Discovery ）
研究意义
03
Refresh-seq具有均匀性高、等位基因脱落率低的特点，在非整倍体精子和卵母细胞筛查中具有良好的应用前景。由于其与NGS平台相比具有较长的读取长度，因此在检测高度重复或低复杂性的基因组区域的SVs方面也具有优势。
参考资料：
https://www.nature.com/articles/s41421-023-00638-9
注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。
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