中科院通过大肠杆菌多重代谢工程异源生物合成异戊二烯化白藜芦醇

多酚，包括黄酮类和芪类，是植物中普遍存在的次生代谢产物，在促进人类健康方面有着悠久的历史。芪类化合物对于人体而言具有诸多益处，例如抗氧化、神经保护、抗炎、抗癌、抗菌和抗糖尿病等，因此被认为是天然对抗各种人类疾病不可或缺的成分。

在芪类化合物中，白藜芦醇由于其在食品、药品和化妆品中的广泛应用而备受瞩目。然而，白藜芦醇在药代动力学方面仍然存在挑战，例如半衰期短，溶解度、吸收性能和生物利用度有限，难以达到治疗所需的血浆浓度。

异戊烯基化是一种常见的化学修饰手段，能够调整多酚的极性、亲脂性和生物功能，从而提高其生物利用度。研究表明，与未异戊烯基化的白藜芦醇相比，异戊烯基化的白藜芦醇具有更高的生物活性。然而，这些化合物在自然界中的稀缺性对其在药物和营养品领域的应用构成了挑战。通过植物提取获得异戊烯基化多酚不仅在经济上不可行，而且对环境有害。因此，迫切需要设计高效、环保、可持续的合成方法来生产这些分子。

近期，来自中国科学院华南植物园的杨宝团队通过白藜芦醇合成途径和戊烯化途径在大肠杆菌体内的共表达，成功实现了异戊二烯化白藜芦醇的生物合成。在此基础上，通过对相关酶的过表达和代谢通量重塑，进一步促进了重要前体物质乙酰辅酶 A和丙二酰辅酶 A的积累，最终创建出高产菌株。其体内白藜芦醇烯丙基化效率高达 71% 至 87%，产量高达 68.4 mg/L。

这项研究成果已经以“Heterologous biosynthesis of prenylated resveratrol through multiplex metabolic engineering in Escherichia coli”为题发表在了Green Chemistry上，该论文的通讯作者是中国科学院华南植物园研究员杨宝，他主要从事功能食品学方向的研究。

▲图 | （来源：Green Chemistry）

论文中首先分别指出了白藜芦醇的生物合成途径及其异戊烯基化的机制。

白藜芦醇生物合成的底物是 L-苯丙氨酸或 L-酪氨酸，在苯丙氨酸裂解酶（PAL）或酪氨酸氨裂解酶（TAL）催化下脱氨形成对香豆酸（p-CA）。p-CA 被 4-香豆酰辅酶 A 连接酶（4CL）转化为 4-香豆酰辅酶 A，进而与三分子丙二酰辅酶 A 在芪合酶（STS）的作用下缩合成白藜芦醇。

白藜芦醇的异戊烯基化是在芳香异戊烯基转移酶（aPT）的催化下实现的。aPT 促进异戊烯基团从异戊烯基供体（如二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）或香叶基二磷酸（GPP））转移到不同的芳香受体。

▲图 | DMAPP 的合成途径，以及白藜芦醇的戊烯化（来源：上述论文）

在这项研究中，研究团队首先证明了来自植物内生菌P. fici中的一种戊烯基转移酶 IacE能够特异性催化白藜芦醇的异戊烯基化。IacE 在细菌细胞内的催化活性与其体外活性一致，并且表现出对 DMAPP 作为异戊二烯基供体的偏好，当以 DMAPP 为戊烯基供体时，转化率高达 80%。

为了提高合成效率，减轻双质粒发酵带来的细胞生长负担，研究团队将 IacE 和 DMAPP 合成途径整合到同一个质粒 pJBEI6410-3 中。此外，他们改进了培养条件，筛选出产量最高的宿主菌株 BL21(DE3) ，并验证了在矿物培养基中白藜芦醇的戊烯化率最高。在 OD600 介于 0.4 和 0.6 之间时，引入 1 mM 诱导物IPTG后，转化效率从 71% 到 87% 不等。

为了在大肠杆菌中合成异戊烯基白藜芦醇，研究团队引入了从 p-CA 到白藜芦醇的合成途径，并使用不同的 IPTG 诱导评估其在矿物介质中生产异戊烯基白藜芦醇的能力。结果表明，在 0.05 和 0.1 mM IPTG 的诱导下，目标产物的滴度相当，分别为12.7 和 12.9 mg/L。然而，随着 IPTG 的浓度进一步增加，产量有所下降。值得注意的是，当 IPTG 浓度超过 0.5 mM 时，培养基中残留的 p-CA 的含量有所下降，这表明 IPTG 用量与 p-CA 降解存在相关性。

通过白藜芦醇合成途径和异戊烯基化途径的共表达，研究团队实现了异戊烯基白藜芦醇在大肠杆菌中的生物合成。然而，其产量仍然不理想，在发酵培养物中明显观察到 p-CA 和白藜芦醇的大量积累，这表明两种化合物没有被有效地转化为下游产物。

为了提高底物利用率，研究团队分析了合成过程中的关键代谢节点，认为细胞内乙酰辅酶 A和丙二酰辅酶 A的可用性是调节异戊烯基白藜芦醇生物合成速率的关键因素。他们将大肠杆菌基因组上的 acs、accA 和 accBC 的启动子区域替换为强组成型启动子 J23119 来增加这两种代谢物的产生，然而，结果证明尽管某些突变体与野生型 BL21（DE3）相比产量相似或略有提高，但这种差异并不显著，不具有统计学意义。与此同时，多数突变体在培养基中残留的 p-CA 浓度升高，且目标产物产量下降，这一结果可能源于突变体中启动子编辑诱导的基因组破坏或代谢扰动。

研究团队进一步分析认为，TCA 循环、DMAPP和乙酰辅酶 A交界处白藜芦醇生物合成之间的碳通量竞争造成了高效生产异戊烯基白藜芦醇的瓶颈。乙酰辅酶 A通过柠檬酸合成酶进入 TCA，丙二酰辅酶 A在酰基载体蛋白（ACP）激活下用于脂质合成，极大地削弱了两种重要前体物质的可用性。为解决这一问题，他们引入了针对相关代谢酶的反义 RNA（asRNAs），在IPTG 诱导下，转录的 asRNA 会与各自的靶基因 mRNA 结合，阻止随后的翻译，从而抑制预期途径以增加乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 的积累。

观测结果显示，表达 asRNAs 的菌株的异戊烯基白藜芦醇产量显著增加，且 p-CA 浓度明显降低，最终滴度达到 68.4 mg/L，比基线菌株提高了 5.3 倍，这证明了这一策略的有效性。

▲图 | 大肠杆菌合成异戊烯基白藜芦醇的多重代谢工程（来源：上述论文）

综上所述，这项工作标志着微生物生产戊烯基化二苯乙烯类化合物的首次成功尝试，为这些化合物的后续应用奠定了坚实的基础。

素材来源官方媒体/网络新闻

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