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间充质干细胞通过CXCL12/CXCR4轴抑制ARDS引起的肺泡上皮细胞凋亡

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急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种肺部炎症性损伤,其特点是急性呼吸衰竭,可导致肺顺应性和CO2突然下降,肺容积减少,导致低氧血症和呼吸窘迫。但是,ARDS的发病机制目前尚不清楚。

间充质干细胞是从骨髓和其他组织中分离出来的非造血干细胞,具有免疫调节和再生特性,可直接抑制疾病对器官的损害或通过减少细胞死亡间接抑制有害因子的释放,有效避免炎症发生,组织损伤和器官衰竭恶化。有研究指出,ARDS患者静脉输注间充质干细胞可通过释放多种生物活性因子,与受损组织相互作用,减轻肺损伤,改善患者的长期肺功能。

另一方面,研究表明,MSCs的局部应用可通过CXCL12/CXCR4信号轴促进内源性细胞增殖、血管生成和裂解,参与创面修复过程。CXCL12是一种关键趋化因子,参与多种稳态过程,如神经调节、胚胎发生、血管和淋巴细胞形成,其表达在组织愈合和伤口愈合过程中上调。此外,CXCL12是CXCR4唯一的趋化因子配体,CXCR4常在造血干细胞、淋巴细胞和骨髓内皮细胞的细胞膜上表达。CXCL12与CXCR4结合后,调节多种信号通路,包括基因转录、细胞增殖、存活和凋亡,并参与免疫缺陷、炎症性疾病和癌症的发展。

ARDS患者常表现出广泛的肺泡上皮损伤和炎症性水肿。最新研究表明,细胞凋亡和裂解是ARDS肺泡损伤的关键特征,可能与肺泡血管内皮损伤有关。

湖南省湘潭市中心医院外科重症监护室课题组的一项研究以TNF-α刺激肺细胞凋亡构建A549/MSCs体外共培养模型,并通过尾静脉注射MSCs构建LPS诱导的ARDS小鼠模型。通过敲低CXCL12和CXCR4的表达,探讨MSCs对ARDS细胞凋亡的影响。研究首次发现MSCs抑制ARDS引起的肺泡上皮细胞凋亡,揭示了MSCs在肺泡上皮细胞中的作用是通过CXCL12/CXCR4轴调控的机制。

TNF-α诱导A549细胞凋亡和裂解并抑制细胞增殖

A549细胞(肺癌人类肺泡基底上皮细胞)用25 ng/ml TNF-α(肿瘤坏死因子-α)处理,体外建立急性肺损伤模型。CCK-8和Celltiter-Lumi检测显示,细胞增殖和活力呈时间依赖性下降(图1 a-b)。与对照组相比,TNF-α组ROS、MDA水平升高,SOD、GSH-px水平降低(图1 c-d),Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的活性显著增强(图1 e)。蛋白质印迹检测显示,TNF-α组Caspase 1、Cleaved Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 11、Bax、GSDMD表达上调,而Bcl-2、p-ERK1/ 2、WNT、β-catenin、Cyclin D1表达下调(图1 f)。这些结果表明,TNF-α增强了A549细胞的凋亡、裂解和氧化,但降低了抗氧化水平和细胞增殖。

(a)CCK-8检测细胞增殖;(b)Celltiter-Lumi检测细胞活力;(c)细胞氧化水平检测;(d)细胞氧化应激水平检测;(e)Caspase活性检测;(f)蛋白质表达的蛋白质印迹检测。

MSCs通过CXCL12/CXCR4轴抑制TNF-α诱导的细胞凋亡和裂解,促进细胞增殖

CCK-8和Celltiter-Lumi检测到MSCs处理逆转了细胞增殖和活力的下降(图2 a-b)。蛋白质印迹结果显示,MSCs组中Caspase 9、Caspase 11、Bax和GSDMD表达下调,Bcl-2、p-ERK1/2、WNT、β-catenin和Cyclin D1表达上调(图2 c)。与MSCs共培养后,TNF-α处理的A549细胞中ROS和MDA水平升高,SOD和GSH-px水平降低(图2 d-e),Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的活性受到抑制(图2 f)。ELISA显示,TNF-α处理后A549细胞中CXCL12的表达上调(图2 g)。

(a)CCK-8检测细胞增殖;(b)Celltiter-Lumi检测细胞活力;(c)蛋白质表达的蛋白质印迹检测;(d)细胞氧化水平检测;(e)细胞氧化应激水平检测;(f)Caspase活性检测;(g)A549细胞培养基中CXCL12的ELISA检测。

MSCs通过CXCL12/CXCR4轴减少ARDS肺组织的病理损伤

在荧光显微镜下,实验发现,shCXCL12 + shCXCR4组肺组织中MSCs的数量明显少于shCXCL12 + MSCs组和shCXCR4+ MSCs组(图3 a)。此外,shCXCL12 + shCXCR4组小鼠肺组织表现出广泛的间质水肿、出血和炎性细胞浸润,肺泡间隔纤维组织增生,肺泡壁增厚,肺泡结构严重受损。MSCs明显减轻了肺组织的病理损伤,减少了胶原纤维。

小鼠肺损伤评分和肺纤维化评分显著降低,敲低CXCR4或CXCL12可逆转MSCs对ARDS小鼠的治疗作用(图3 b-d)。shCXCL12 + shCXCR4组血清ROS、MDA水平升高,SOD、GSH-px水平降低(图3 e-f)。Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9活性的抑制被逆转(图3 g)。与MSCs组、shCXCR4或shCXCL12组相比,shCXCL12 + shCXCR4组血清IL-1β、TNF-α水平升高,IL-10水平降低(图3 h)。在shCXCL12 + shCXCR4组小鼠组织中,Caspase 1、Cleaved Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 11、Bax、GSDMD的表达上调,Bcl-2、p-ERK1/2、WNT、β-catenin、x Cyclin D1的表达下调(图3 i)。在敲除CXCR4或(和)CXCL12的表达后,MSCs对ARDS小鼠的肺组织失去了修复作用。

(a)荧光观察小鼠肺组织中MSCs的分布;(b)HE染色观察小鼠肺组织的病理变化和纤维化情况;(c)Masson染色观察小鼠肺组织的病理变化和纤维化;(d)小鼠肺损伤评分和肺纤维化评分;(e)组织氧化水平检测;(f)组织氧化应激水平检测;(g)Caspase活性检测;(h)ELISA检测小鼠血清炎症相关因子;(i)蛋白质表达的蛋白质印迹检测。

总之,该结果表明TNF-α增强了A549细胞的凋亡、裂解和氧化,但降低了抗氧化水平和细胞增殖。此外,MSCs可通过CXCL12/CXCR4信号轴抑制TNF-α诱导的细胞凋亡和裂解,促进细胞增殖,减轻ARDS肺组织的病理损伤。综上所述,MSCs可通过CXCL12/CXCR4信号轴抑制TNF-α和LPS诱导的肺细胞凋亡,从而改善ARDS小鼠肺组织损伤和肺纤维化。这些发现为ARDS中MSCs的干预目标提供了新的见解。

参考文献:He X, Li C, Yin H, Tan X, Yi J, Tian S, Wang Y, Liu J. Mesenchymal stem cells inhibited the apoptosis of alveolar epithelial cells caused by ARDS through CXCL12/CXCR4 axis. Bioengineered. 2022 Apr;13(4):9060-9070. doi: 10.1080/21655979.2022.2052652. PMID: 35301927; PMCID: PMC9161978.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35301927/

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