Nature子刊-中药单体 | 白藜芦醇通过抑制肠道FXR诱导的清道夫受体SR-B1表达减弱乳糜微粒分泌

文献来源

大家好，今天跟大家分享的文献是2023年5月9日来自中山大学的凌文华教授、加拿大多伦多大学Khosrow Adeli与Tianru Jin 在Nature communication杂志上发表了一篇题为Resveratrol intervention attenuates chylomicron secretion via repressing intestinal FXR-induced expression of scavenger receptor SR-B1的文章。发现了REV-l以前未被认识的功能:抑制肠道乳糜微粒分泌。肠道SR-B1被REV-l下调，而肝脏SR-B1未被下调。通过粪便微生物群移植(FMT)揭示了REV-l小鼠粪便对改善脂肪耐受性和降低空肠SR-B1的作用。行了FE代谢组学分析和肠道微生物组学分析，从而认识到胆汁酸/FXR激活可以刺激空肠SR-B1表达，而REV-I可以减弱HFD挑战诱导的粪便胆汁酸升高。

研究背景

许多天然产品已被证明具有有益的代谢作用，并在世界范围内推广用于预防甚至治疗代谢性疾病，包括2型糖尿病(T2D)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和心血管疾病(CVD)。其中，包括白藜芦醇在内的植物源性膳食多酚类物质最受生物医学研究人员、药物开发人员和营养科学家的关注。这些化合物可以改善动物模型和人类受试者的胰岛素信号和能量稳态。几十年来，两个基本的问题限制了对它们功能的机械理解。首先，这些多酚经常被证明针对多个器官或信号级联，没有明确的受体。其次，它们的生物利用度极低。大量摄入酚类化合物后，其最大血浆浓度很少超过1µM。因此，膳食多酚可能首先在肠道中发挥作用，因为肠道中多酚的浓度最高，可能针对肠道微生物群。它们可以改变肠道菌群特征，调节细菌产物或食物发酵产物的产生，或通过特定多酚的肠道代谢物发挥作用。事实上，最近的几项研究表明，白藜芦醇干预(REV-I)的有益作用与肠道微生物群的改变有关。

胰岛素抵抗期间，肠道中含有载脂蛋白48的乳糜微粒的产生显著增加，而其清除在T2D或NAFLD中受损。乳糜微粒是循环中富含甘油三酯(TG)的脂蛋白(TRL)的主要形式，而另一种是肝脏中产生的极低密度脂蛋白(VLDL)。乳糜微粒的主要脂质组成是TG，其次是胆固醇酯形式的膳食胆固醇。研究表明餐后高甘油三酯血症是心血管疾病的有力预测指标。脂解后的乳糜微粒残余物可进入动脉内膜，残余胆固醇可在内膜泡沫细胞内积聚形成动脉粥样硬化斑块。乳糜微粒残留物也会被肝脏吸收，增加NAFLD的风险。乳糜微粒的产生发生在肠细胞中，涉及膳食脂肪酸(FA)的摄取、TG的合成、乳糜微粒的组装和跨基底外膜的分泌。多种脂质转运蛋白参与这一过程，包括簇决定因子36 (CD36)、清道夫受体B类1型(SR-B1)、和FA转运蛋白4 (FATP4)。其中，SR-B1在胰岛素抵抗仓鼠模型小肠中升高最多，与餐后TG和TRL积累增加有关。SR-B1基因敲除(KO)小鼠或接受SR-B1抑制剂治疗的小鼠乳糜微粒产生减少。

这篇文章报告了REV-l以前未被认识的功能:抑制肠道乳糜微粒分泌。肠道SR-B1被REV-l下调，而肝脏SR-B1未被下调。粪便微生物群移植(FMT)揭示了REV-l小鼠粪便对改善脂肪耐受性和降低空肠SR-B1的作用。进行了FE代谢组学分析和肠道微生物组学分析，从而认识到胆汁酸/FXR激活可以刺激空肠SR-B1表达，而REV-I可以减弱HFD挑战诱导的粪便胆汁酸升高。

研究结果

1.REV-l可减少HFD喂养小鼠乳糜微粒的产生

如图1a所示，6周龄C57BL/6J雄性小鼠分别饲喂LFD、HFD或HFD + REV-l (HFR) 8周。REV-l降低了HFD引起的体重增加(图1b, c)，降低了脂肪量和肝脏脂肪含量，但没有降低肝/体重比。REV-l改善了葡萄糖和胰岛素耐量，同时降低了空腹葡萄糖和胰岛素水平(图1d-g)。当根据基础血糖水平调整后，在目前的实验设置中，胰岛素耐量的改善几乎没有出现(补充图1e)。此外，REV-l降低了空腹TG水平，但没有降低非酯化FA (NEFA)水平，NEFA主要通过FA脂解来源于脂肪细胞(图1h, i)。

血浆TG水平由乳糜微粒生成、肝脏VLDL生成和TRL清除率之间的平衡决定。当用poloxam407阻断过夜禁食小鼠的脂蛋白脂肪酶(LPL)活性时，三组小鼠的血浆TG水平没有差异(补充图1f)，表明REV-l在当前实验环境中不会显著影响禁食期间肝脏VLDL的产生。与此一致的是，REV-l并没有降低HFD诱导的空腹ApoB48和TRL中TG的含量(补充图1g, h)。此外，三组小鼠的血浆LPL活性相似(补充图1i)。在餐后条件下，橄榄油刺激小鼠的血浆TG积累被REV-l减少(图1j)。虽然HFR小鼠的AUC似乎比HFD小鼠更低，但差异没有达到统计学意义。通过评估分离TRL中TG含量和ApoB48水平来测定乳糜微粒的产生，REV-l降低了小鼠乳糜微粒的产生(图1k, l)。这些观察结果表明，REV-I通过抑制喂养状态下乳糜微粒的产生来降低血浆TG。图1m总结了在这组小鼠中观察到的REV-l的代谢作用。

FigureS1.

( a )指定3组小鼠脂肪质量与体质量的比值；n = 5。

( b )肝脏样本油红O染色代表性图像。标尺为25μm。

( c )肝重/体重比；n = 5。

( d )三组小鼠在整个8周期间的摄食量；LFD组和HFD组n = 3，HFR组n = 4。

( e ) IPITT期间血糖水平( %)和AUC；n = 5。

( f )禁食过夜的小鼠按1g / kg腹腔注射泊洛沙姆407以阻断脂蛋白的脂解。在规定的时间收集血浆并分析TG浓度；n = 4。

( g , h)取注射泊洛沙姆407后4 h的血浆，超速离心分离TRL，测定Apo B48 ( g )和TG浓度( h )；n = 4。

( i )肝素后血浆LPL活性测定；n= 5 . i WAT，腹股沟白色脂肪组织；EWAT，附睾白色脂肪组织；MWAT，肠系膜白色脂肪组织；BAT，棕色脂肪组织。

Figure1.

a:实验过程示意图。

b-c:8周后小鼠体重变化(b 和体重增加(c);LFD组和HFD组n = 13, HFR组n =14。

d-e:OGTT (d)和IPITT (e)期间血糖水平和曲线下面积(AUC);n= 5。空腹血糖(FBG) 。

f:(n=13-14)、空腹胰岛素(FBI) 。

g:(n=5)、TG

h:(n = 1 - 3-14, c)和非酯化FA (NEFA)水平(i) (n=4)。

J:FTT期间餐后TG水平;n= 4 。

k-l:橄榄油灌胃后4 h采集餐后血浆，进行超离心分离TRL(主要是乳糜微粒)。然后测量TG浓度(k)，同时通过Western blotting评估ApoB48水平(l);n=4。

m:热图总结了图中REV-l的代谢效应(给定参数变化的倍数与饲喂HFD的小鼠相比，定义为1倍)。

2.REV-l降低空肠SR-B1，但不降低肝脏SR-B1

膳食脂质摄入和新生脂肪生成导致肠道脂滴积累，然后被包装为乳糜微粒，或通过FA β氧化。乳糜微粒通过基底外侧膜分泌到乳糜管中，在乳糜管中与淋巴结合成为乳糜微粒(图2a)。在另一组有或没有8周REV-l的小鼠中，我们测量了TG的摄入量及其粪便排出量。HFD刺激导致TG摄入量和粪便TG输出量升高，但REV-l并没有减少TG摄入量或增加其输出量(图2b, c)，这表明REV-l没有显著影响肠道TG吸收。甘油三酯在肠道中的积累保持在相当水平(图2d)。然后我们测量了空肠中与脂质代谢相关的基因的表达。REV-l不影响与TG摄取、新生脂肪生成或乳糜颗粒组装相关的基因的表达，但减弱了HFD对Scarb1(编码SR-B1)表达的刺激，并增加了负责脂肪分解和FA β-氧化的基因的表达(图2e)。重要的是，REV-l使空肠SR-B1蛋白水平降低了54%，而不是肝脏SR-B1蛋白水平(图2f)。肠顶端膜SR-B1介导脂质感知和乳糜微粒分泌。我们在这里表明，REV-l也减弱了SR-B1的顶端迁移(图2g, h)。

Figure2.

a:图表总结了肠道脂质(TG)稳态的代谢过程。第8周末，代谢笼中小鼠的平均TG摄入量.

b:和每日粪便TG损失.

c:n=6。

d空肠细胞内TG含量;n=4。

e.热图显示了三组小鼠肠道脂质代谢相关基因的表达情况;n=1。

f.空肠(n=9)和空肠(n=3)采用Western blotting检测SR-B1水平。

g.具有代表性的空肠SR-B1免疫染色图像(棕色)，以及其顶膜的定量评分。比例尺为300 μm;n=3。

h.具有代表性的空肠SR-B1免疫荧光染色图像(红色)，以及其在顶膜处的定量评分。比例尺为500 μm;N = 3。采用双侧单因素方差分析和Dunnett事后检验评估统计学意义(与HFD组比较)。

3.肠道黏膜特异性SR-B1 KO小鼠对REV-l缺乏进一步的应答

为了进一步探讨肠道SR-B1的作用，我们在肠黏膜特异性SR-B1 KO (iScarb1−/−)中进行了实验(图3a)。iScarb1−/−和对照Scarb1fl/fl小鼠分别饲喂HFD，不饲喂REV-l或饲喂REV-l 8周。补充图2a-d是我们对SR-B1肠道粘膜特异性KO的验证，并观察到6周龄时iScarb1 -/-和对照小鼠的基础体重和空腹TG水平具有可比性。在HFD刺激后，与Scarb1fl/fl小鼠相比，iScarb1−/−小鼠的体重增加更低(图3b, c)。同时服用REV-l 8周可减少对照组的体重增加，但iScarb1−/−小鼠没有(图3c)。在对照组而非iScarb1−/−小鼠中，REV-l减少了白色脂肪质量，而四组小鼠的肝脏重量与体重比相当(补充图2e, f)。图3d-f显示，REV-l改善了Scarb1fl/fl小鼠的葡萄糖和胰岛素耐量，但在iScarb1−/−小鼠中没有观察到REV-l进一步改善。重要的是，iScarb1−/−小鼠表现出较低的空腹和餐后血浆TG积累(图3g, h)，以及较低的TRL中TG和ApoB48水平(图3i, j)。然而，REV-l在iScarb1−/−小鼠中没有进一步降低这些参数(图3g-j)。此外，REV-l在Scarb1fl/fl小鼠中增强了Cpt1a和Acadm的表达，而在iScarb1−/−小鼠中则没有(图3k)。图3l总结了REV-l在这四组小鼠中的作用结果，提示肠道SR-B1是REV-l改善能量稳态和减少乳糜微粒分泌的主要靶点。

Figure3.

a图显示了Scarb1fl/fl和iScarb1−/−小鼠的实验过程。

b-c:第8周末体重(b)和体重增加(c); iScarb1−/− -R组和Scarb1fl/fl +R组n=10；Scarb1fl/fl -R组n=11；iScarb1−/− +R组n=12。

d:在8周结束时检测血液葡萄糖。n = 10 - 12, as (b, c)，

e-f:OGTT(e) 和 IPITT (f)的血浆葡萄糖水平和AUC ， n = 10 - 12 as (b, c)。

g:第8周空腹TG水平;N = 10 - 12 as (c)。

h:FTT期间餐后TG水平;Scarb1fl/fl -R组n=5；Scarb1fl/fl +R组n=6；iScarb1−/− -R组n=7；iScarb1−/− +R组n=8.

i-j:橄榄油灌胃后4 h采集餐后血浆，进行超离心分离TRL。然后测量TG浓度(i)，评估ApoB48水平(j)(白蛋白作为负载对照);n=3。

k:参与FA β-氧化的Cd36等基因的表达;n = 5-8 a s (h)。

l；热图总结了图中REV- 1的代谢作用。

FigureS2.

( a ) qRT - PCR显示Scarb1fl/fl对照小鼠和肠道SR-B1基因敲除( iScarb1-/- )小鼠不同组织中Scarb1 (用编码β- actin的Actb进行标准化)的mRNA相对水平；n = 3。

( b ) Western blotting检测SR-B1在Scarb1fl/fl和iScarb1-/-小鼠各组织中的表达；n = 3。

( c、d)基础体重( c )和空腹TG水平( d )；n = 10 - 12如图3b - c。

( e , f)比较指定脂肪质量与体重比( e )和肝重比( f )；n= 10 - 12如图3b - c。J，空肠；WAT，白色脂肪组织；BAT，棕色脂肪组织。

4.BLT-1灌胃与REV-l无加性作用

然后，我们通过口服SR-B1抑制剂BLT-1进一步测试了肠道SR-B1在REV -1介导作用中的作用。C57BL/6J小鼠分别饲喂LFD、HFD或HFR 4周(图4a)。然后HFD组和HFR组进一步分为两个亚组，不给药或每天给药2周以上。BLT-1或REV-1减轻了HFD诱导的体重增加，但它们没有产生附加效应(图4b, c)。两周的BLT-1灌胃或6周的REV-1或两者联合使用并不能阻止HFD诱导的附睾脂肪量增加，也不会改变肝脏重量与体重的比例(图4d, e)。此外，BLT-1不能降低空腹血糖水平，而REV -1可以(图4f)。所有治疗组小鼠均表现出空腹和餐后TG水平降低，乳糜微粒生成减少(图4g-j)。同样，REV -1和BLT-1联合使用也不会产生加性效应(图4g-j)。

Figure4.

a:图中显示了用白藜芦醇(HFR)或BLT-1 (B)或两者(HFR + B)处理C57BL/6J小鼠的实验过程体重。

b:图和体重增加.

c:从4-6周开始。LFD组n=5，HFD组n=6，HFR+B组n=7，HFD+B和HFR+B组n=8。第6周结束时的附睾白色脂肪组织重量。

d:肝脏平均重量。

e:空腹血糖。

f:和TG水平。

g:n =5–8 as (b, c)。

h:FTT时血浆TG水平;n= 4。i, j.橄榄油灌胃后4 h采集餐后血浆，进行超离心分离TRL。然后测量TG浓度。

i:并通过Western blotting评估ApoB48水平。

j:n= 3。采用双侧单因素方差分析和Dunnett事后检验评估统计学意义(与HFD组比较)。

5.REV-l通过降低NF-κB-p65的转录活性来抑制空肠SR-B1

为了探究REV -1如何下调SR-B1，我们定位了Scarb1启动子上的转录因子结合基序，包括SREBP-1的转录因子结合基序。然而，Western blotting显示，在LFD、HFD和HFR组中空肠SREBP-1水平相当(图5a)。虽然qRTPCR显示HFD小鼠空肠Srebf1升高，但REV-1不抑制Srebf1，对SREBP-1下游靶点的表达没有影响(图5b)。在人类和啮齿动物的SCARB1或SCARB1启动子中，我们找到了NF-κB-p65的保守结合基序(图5c)。8周的HFD刺激增加了空肠NF-κB-p65的表达，而REV-I抑制了这种增加(图5d)。这种阻断与NF-κB信号成员基因(图5e)和NLRP3炎症小体关键成员基因(图5f)的抑制有关。通过ChIP方法，我们观察到HFD小鼠中NF-κB-p65或RNA聚合酶II与Scarb1启动子的相互作用增加，而REV-l减弱了它们的相互作用(图5-j)。

Figure5.

a：Western blot检测空肠SREBP-1的表达;n= 3。

b：编码SREBP-1的Srebf1及其靶基因在空肠中的表达比较;n=8。

c：保守的NF-κB p65结合基序在人、大鼠和小鼠SCARB1/ SCARB1启动子和ChIP和qChIP中使用的核苷酸引物中的位置。

d：免疫印迹法检测指示组小鼠空肠细胞质和细胞核NF-κB-p65，见图1;n = 4。剥离NF-κB-p65的印迹，重新探测Lamin A。

e：热图显示了空肠中已知受NFκB调节的肠道炎症基因的比较;n = 8 (qRT-PCR统计分析结果见补充表5)。

f：免疫印迹显示空肠炎性小体成分的相对表达。N = 3。剥去Pro-caspase-1印迹，重新检测β-actin。ChIP显示NF-κB o或r N A聚合酶II与小鼠空肠中Scarb1启动子

g)：(N = 6)结合，但未与内含子区

h：(N = 3)结合。qChIP显示NF-κB

i：(n = 6)与RNA聚合酶II

j：(n = 3)在空肠中与Scarb1启动子结合的比较。采用双侧单因素方差分析和Dunnett事后检验评估统计学意义(与HFD组比较)。

6.REV-l对肠道SR-B1的抑制作用涉及肠道微生物组

在Caco-2细胞中，白藜芦醇在不影响细胞活力的剂量(1、5和25µM)下处理，我们观察到SR-B1或NF-κBp65在蛋白质或mRNA水平上没有抑制(补充图3a-c)。然后，我们通过在微孔PET transwell插入物中培养Caco-2 21天建立肠道屏障模型，使细胞分化成具有极性的单层(补充图3d)。脂质胶束刺激乳糜微粒分泌，通过测量分泌到下腔室的标记C12 FA的BODIPY检测。然而，白藜芦醇治疗并没有降低其升高(补充图3e)。白藜芦醇体内和体外对SR-B1影响的差异表明，空肠SR-B1调节涉及体外不存在的实体，如肠道微生物群。因此，我们收集了饲喂HFD或HFR 8周的小鼠的新鲜粪便。经过超声和过滤，我们收集无菌FEs。当HFD-FE或HFR-FE被稀释150倍或更高时，我们没有看到它们对Caco-2活力的抑制(补充图4a, b)。当这些FEs(稀释为1:1200)应用于Caco-2衍生的肠道屏障模型时，HFR-FE处理的细胞显示出相对较低的乳糜颗粒分泌水平(补充图4c)。此外，当施加HFR-FE时，HFD-FE对SR-B1和NF-kB p65的刺激作用不存在(补充图4d, e)。我们将无菌FEs在95°C下处理5分钟，然后将其施加于Caco-2。如图(补充图4f)所示，加热HFR-FE处理的Caco-2细胞的SR-B1水平低于加热HFD-FE处理的Caco-2细胞。因此，REV-l对肠道NF-κB和SR-B1的调节作用可能与粪便中的某些热稳定产物有关。

FigureS3.

( a ) MTT法检测不同剂量白藜芦醇对Caco - 2细胞活力的影响；n = 8。

( b ) 1、5和25 μ M白藜芦醇处理Caco - 2细胞4或8 h后，SR - B1和NF - κ B - p65的表达；n = 3。整个印迹被剥离并重新检测NF - κ B - p65。

( c ) 1、5、25 μ M白藜芦醇处理Caco - 2细胞4或8 h后，SCARB1、RELA (编码人NF - κ B - p65)基因的表达；n = 3。

( d )分化Caco - 2细胞建立肠屏障模型示意图。

( e ) BODIPY标记的C12脂肪酸在白藜芦醇( 25μM )处理8 h的Caco - 2屏障模型下室中的检测；n = 8。

FigureS4.

a：MTT法检测FE对Caco - 2细胞活力的影响；n = 8。

(c) Detection of BODIPY labelled C12 fatty acid in the lower compartment of the Caco-2 barrier model treated with indicated FE (1:1200 dilution) for 4 h. Lipid micelle (LM) was applied to all samples; n=8。

(d)Western blotting检测Caco - 2细胞经不同稀释倍数的FE处理8 h后SR - B1的表达；n = 3。

( e ) Western blotting检测不同稀释倍数的FE处理Caco - 2细胞8 h后NF - κ B p65的表达；n = 3。

( f ) FE ( 95℃水浴5 min , 1 : 600稀释)热处理8 h后Caco - 2细胞中SR - B1的检测；n = 3。

之后，我们进行了为期12天的FMT，其中小鼠在第1、3和5天接受了HFD饲喂小鼠(HFD-FMT)、HFR处理小鼠(HFR-FMT)或HFR饲喂小鼠加白藜芦醇灌胃(500 mg/kg体重)的粪浆形式的FMT(图6a)。我们设计了这个短期的FMT，目的是了解在REV-l治疗小鼠的FMT对降低体重和葡萄糖稳态的已知作用之前，肠道SR-B1的抑制是否会发生。在第7天，我们没有看到LFD组或HFD组的糖耐量改变(图6b)， FMT也没有影响LFD组或HFD组小鼠的体重增加(图6c, d)。我们也没有看到给予FMT对空腹TG水平的影响(图6e)。当第12天进行FMT时，小鼠在血浆LPL活性阻断后被橄榄油攻击，在LFD组中，接受HFD-FMT + R的小鼠显示出最高的餐后TG水平(图6f)。虽然我们还不能对这种升高提供一个确凿的解释，但这一观察表明白藜芦醇的脂质稳态作用不能在短期内(3天灌胃)实现，因为白藜芦醇“重塑”肠道微生物群需要更长的时间。重要的是，在HFD组中，与接受HFD- FMT的小鼠相比，接受HFR-FMT的小鼠餐后TG水平较低(图6f)。在离体餐后TRL中，与接受HFD-FMT的小鼠相比，接受HFR-FMT的小鼠TG和ApoB48水平较低，但差异没有达到统计学意义(图6g, h)。最后，接受HFR-FMT的小鼠空肠SR-B1水平低于接受HFD-FMT的小鼠(图6i)。

Figure6.

a图表显示了短期FMT的设计。6周龄雄性小鼠经LFD或HFD治疗4周后，再随机分为3组，在PEG3350治疗后接受指示性FMT。

b：OGTT第7天血糖水平及AUC。

c ：FMT前的基础体重。d从第0天到第12天体重增加。

e：第12天空腹TG水平。

f：第12天FTT期间餐后TG水平。

g, h：在橄榄油灌胃后4 h采集餐后血浆，进行超离心分离TRL。然后测定TG浓度(g)， Western blotting测定ApoB48水平(h)。

i：空肠SR-B1水平。上述试验中LFD-HFD-FMT和HFD-HFD-FMT组n = 4，其他组n = 5。采用Šidák事后检验的双侧双因素方差分析评价统计学显著性。

7.REV-l可减弱HFD诱导的粪胆汁酸升高

研究人员开始探索REV-l后与空肠SR-B1抑制相关的粪便变化。首先，研究了两种市售的肠道微生物代谢物反式白藜芦醇DHR和半月苔酚(补充图5a)是否抑制SR-B1。在LPS和IFN-γ预处理的Caco-2细胞中，DHR通过抑制IL-6和TNF(分别编码人IL-6和TNF-α)的表达而发挥抗炎作用。然而，在没有或存在LPS和IFN-γ预处理的情况下，处理并没有降低SCARB1和RELA的表达(补充图5b-d)。

FigureS5.

( a )图表明，反式白藜芦醇可以被肠道微生物降解为三种代谢物，分别称为二氢藜芦醇( DHR )、半月苔酚和3，4 ' -二羟基反式二苯乙烯。第三种不具备商业可得性。

( b ) 25μM DHR处理Caco - 2细胞8 h后SCARB1和RELA的表达；n = 3。

( c ) 25μM半月苔酚处理Caco - 2细胞8 h后SCARB1和RELA的表达；n = 3。

( d )在LPS ( 200ng / m L )和IFN γ ( 200ng / m L )处理8 h后，用25 μ M DHR或25 μ M半月苔酚处理Caco - 2细胞，检测SCARB1、RELA、IL6(编码人IL - 6)和TNF(编码人TNF - α)的表达；n = 4。采用双侧单因素方差分析( two-sided oneway ANOVA with邓尼特' s post hoc test (与LPS + IFN γ组比较) )评估统计学意义。

然后，我们对HFD和HFR小鼠的FEs进行了非靶向代谢组学分析，没有包括LFD组，因为我们主要计划探索热稳定性产品的参与。因此，对HFR-FE样品进行不加热或95℃加热5min处理，后者称为HRH-FE。通过LC-MS/MS分析，我们检测到2053种代谢物。主成分分析(PCA)表明，HFD-FE和HFR-FE中代谢物的组成不同，热处理后，HFR-FE中有很大一部分代谢物发生了转化(补充图6a)。然后，我们进行了差异分析，确定了HFR组和HFD组之间238种差异代谢物，HRH组和HFD组之间432种差异代谢物。与HFD组相比，HFR组增加和减少的前10个代谢物见补充图6b。这些代谢物的生物活性在很大程度上仍然未知。我们选择4′-羟基黄酮在Caco -2细胞中进行测试，因为据报道这种代谢物可以抑制SREBP-1。虽然4′-羟基黄酮能抑制编码IL-6、IL-1β和MCP-1的基因的表达，但不抑制SCARB1或RELA (补充图6c)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。我们的研究结果表明，鞘脂代谢和胆汁酸代谢相关通路主要由REV-l调节(补充图6d)。由于加热前后来自HFR-FE小鼠的FE对SR-B1表达的影响相当，因此我们寻找在HFR-FE和HRH-FE中具有相当水平的化合物。通过K-Means聚类分析，将差异化合物根据其在不同群体中的相对丰度划分为7个亚类。与HFD组相比，只有3亚型患者的HFR-FE和HRH-FE水平明显降低(补充图6e)。亚类3主要含有鞘脂、胆汁酸(BA)和某些氨基酸。通过差异分析，与HFD-FE相比，HFR-FE和H FH-FE中的鹅去氧胆酸(CDCA)和去氧胆酸(DCA)水平均有所降低(图2)。HFR-FE和HRH-FE组石胆酸(LCA)水平也低于HFD-FE组，但差异未达到统计学意义水平。

FigureS6.

( a )主成分分析( PCA )图。来自指定组的无菌FEs进行非靶向代谢组学分析。HFR，HFD喂养小鼠REV - I。HRH，无菌FE从HFR处理的小鼠中分离，在95℃下加热5分钟；n = 5。

( b )与HFD组小鼠相比，HFR组小鼠粪便提取物中排名前10的代谢物(用Log2FC表示)分别增加和减少；n = 5。

( c ) 25、50或100 μ M的4 ' -羟基黄酮(其中最上面显示了分子结构)处理Caco - 2细胞8 h后，SCARB1、RELA、IL6、IL1B (编码人IL - 1 β)和CCL2 (编码人MCP - 1)的表达情况；n = 3。

( d ) KEGG通路富集分析显示REV - I调控的前20个代谢通路，通过检测到的差异代谢物与通路中总代谢物的比值确定Rich Factor。

( e ) K - Means聚类分析将所有差异代谢物按其在不同分组中的相对丰度分为7个亚类。只有亚类3和7在HFR和HRH组中显示出相当的水平。

然后，我们测量了小鼠粪便和血清中某些BAs的水平，并包括LFD喂养小鼠的样本。如图所示，饲喂高热量饲料增加了粪便总BA、CDCA和DCA水平，而REV-l阻止了这些增加(图7c、d)。显然，加热对它们的测量没有影响。在血清中，虽然HFD或REV-l没有改变总BA水平(图7e)，但饲喂HFD增加了包括胆酸(CA)、CDCA和LCA在内的非共轭BAs，并降低了包括TCA、t - α mca和TDCA在内的共轭BAs。重要的是，HFD对CDCA和TCDCA的影响被REV-l逆转(图7e, f)。

BAs在肝脏中合成，在出口到肠道之前与牛磺酸或甘氨酸结合，在肠道细菌产生的BSH将BAs解缀合成非缀合的BA。肝脏BA合成基因Cyp7a1、Cyp7b1和Cyp8b1的mRNA水平被HFD降低，而REV-I恢复了它们的表达(图7g)。重要的是，Cyp2c70的表达被HFD抑制，而REV-l则升高(图7g)，而Cyp2c70是将CDCA转化为MCA的关键基因。与此一致，REV-l后肝脏CDCA水平下降(图7h)。我们还测量了小鼠粪便中的BSH活性，并观察到REV-l降低了HFD激发升高的BSH活性(图7i)。

Figure7

a, b：火山图显示指定FEs中的差异代谢物(由Log2FC和- log10p值确定)。两组的CDCA和DCA在图中标注;n=5。与HFD-FE相比，HFR-FE和HRH-FE的LCA水平也有所降低，但未达到统计学意义。

c：粪便总胆汁酸水平。

d：粪便CDCA和DCA水平。HRH，加热HFR小鼠的粪便。

e：未结合的、牛磺酸结合的和总胆汁酸的血清水平。

f：小鼠血清中主要未结合胆汁酸和牛磺酸结合胆汁酸的水平。

g：肝脏胆汁酸生物合成相关酶编码基因的表达水平;n= 8。

h：肝脏中CDCA的浓度。

i：粪便中BSH的活性由每分钟每毫克蛋白质产生d4-CDCA来定义。每次测试n = 5。与HFD组比较，采用双侧单因素方差分析和Dunnett事后检验评估统计学意义。

然后，我们比较了小鼠在HFD、不含REV-l或含有REV-l的情况下的肠道微生物组组成。补充图7a显示了通过三维主坐标分析(PCoA)可视化的两组Bray-Curtis beta多样性的差异。在门水平上，厚壁菌门的相对丰度呈下降趋势，而拟杆菌门的相对丰度和拟杆菌门/厚壁菌门的比值在HFR组中呈上升趋势(补充图7b, c)。有趣的是，在属水平上，富含bsheni的细菌如乳杆菌、双歧杆菌、梭菌和肠球菌均被REV-l抑制(补充图7d)。我们还分析了小鼠盲肠内容物的肠道微生物组。盲肠内容物样本根据布雷-柯蒂斯β -多样性根据日粮进行分离(补充图7e)。利用Shannon多样性指数、逆Simpson和观察到的分类群指标分析α -多样性差异。与LFD或HFR小鼠相比，HFD喂养小鼠的盲肠样本显示出更低的α多样性(补充图7f)。补充图7g显示了三组小鼠的门分类摘要。与粪便样品的微生物组分析相反，我们没有看到REV-l升高拟杆菌门/厚壁菌门比率(补充图7g)。同样，在HFR组中，产生BSH的细菌包括拟杆菌、梭状芽胞杆菌和肠球菌减少(补充图7h)。因此，除了抑制肝脏BA生成外，REV-l还可能通过抑制产生BSH的肠道微生物群来降低粪便BA水平。

FigureS7

( a ) Bray-Curtis β多样性，PERMANOVA测试三维PCo A可视化；n = 5。

( b ) HFD和HFR组粪便中菌门组成分类汇总的Stacking柱状图；n = 5。

( c )粪便中拟杆菌门( Bacteroidetes )和厚壁菌门( Firmicutes )的相对丰度(左面板)以及拟杆菌门与厚壁菌门的比值(右面板)；n = 5。采用双侧t分布检验和Mann - Whitney非参数检验进行比较。

(d )热图显示了BSH产生菌属的相对丰度；n = 5。

( e ) PCo A可视化Bray - Curtis β多样性；n = 3。

( f ) Alpha多样性差异分别采用Shannon多样性指数、Inverse Simpson和Observing丰富度指数进行评估；n = 3。

( g )盲肠内容物中门组成的分类学总结，以及拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度；n = 3。

( h )热图显示了BSH产生菌属的相对丰度；n = 3。

8.CDCA或GW4064上调Caco-2细胞中的SR-B1，而GW4064阻断REV-l对SR-B1的体内功能

我们选择CDCA作为Caco-2细胞的进一步研究，因为它是Farnesoid X Receptor (FXR)最有效的天然激动剂。先前的研究表明，FXR激活可上调肝脏SR-B1的表达。我们想知道FXR是否激活Caco-2细胞中的SR-B1。CDCA和合成FXR激动剂GW4064均可激活Caco-2细胞中的NR1H4(编码人FXR)及其下游靶标NR0B2(编码人小异源二聚体伴侣SHP)。重要的是，它们还激活了RELA、IL6和SCARB1(图8a)。CDCA/FXR对NF-κB的影响存在争议。为了探讨FXR、NF-κB和SR-B1之间的关系，我们利用了NF-κB的化学抑制剂(QNZ)和FXR 的化学抑制剂(Guggulsterone, Gug，一种存在于gugugul植物树脂中的植物类固醇)。添加Gug阻断了CDCA诱导的SCARB1、NR1H4、NR0B2和FGF19的表达，而添加QNZ则不产生这种阻断(图8b、c)。此外，Gug处理本身激活了RELA，无论QNZ或Gug是否存在，CDCA都能刺激RELA。在QNZ或Gug存在的情况下，CDCA对IL6和IL1b的刺激作用不存在(图8d)。虽然FXR、NF-κB和SR-B1之间的复杂关系需要进一步深入研究，但我们可以得出结论，FXR是CDCA激活肠道SR-B1所必需的。

然后，我们对LFD、HFD或HFR小鼠空肠中FXR信号相关基因的表达进行了8周的评估。虽然HFD没有增加NR1H4的表达，但REV-l抑制了其表达(图8e)。饲喂高脂饲料提高了空肠中Nr0b2和Fgf15的表达水平，而REV-l显著降低了Fgf15的表达水平。对于其他两个FXR相关基因(Slc51a和Slc51b)，没有明显差异(图8e)。这两个基因编码异质有机溶质转运体α/β，负责将BA通过基底外膜输出到体循环。这两个基因的表达主要是由回肠中的胆汁通量诱导的。研究结果表明，HFD和REV-l对它们在空肠mRNA水平上的表达调控窗口是否相对较窄。最后，我们将GW4064纳入另一组雄性小鼠研究。GW4064治疗6周后，HFD喂养小鼠的餐后TG、TRL-TG和TRL-ApoB48水平进一步升高，并且阻断了REV-l的抑制作用(图8f-h)。此外，GW4064处理诱导HFD喂养小鼠空肠SR-B1表达，而非肝脏SR-B1表达，并阻断REV-l对空肠SR-B1表达的减弱作用(图8i)。

Figure8.

a图：在CDCA(200µM)或GW4064(25µM)作用8 h的Caco-2细胞中，NR1H4(编码FXR)、NR0B2(编码SHP)、SCARB1、RELA、a和IL6的相对表达水平;n=3。

b-d图：CDCA、或CDCA +指示抑制剂处理cco -2细胞24 h后，SCARB1、NR1H4、NR0B2、FGF19、RELA、IL6、IL1B的相对表达量。QNZ、NF-κB抑制剂(100 nM);gugugulsterone (Gug)， FXR拮抗剂(20µM);n = 4。

e图;qRT-PCR检测指定小鼠各组空肠中FXR信号通路相关基因的相对表达量;n= 8。

f图：用HFD、HFR、HFD + GW4064 (HFG)或HFR + GW4064 (HFGR)治疗6周的小鼠FTT期间餐后TG水平和AUC。

g图：餐后TRL中的TG水平。

h图：餐后TRL中ApoB48水平。

i图：指定小鼠各组空肠SR-B1水平;以上试验n=7。

j图:显示HFD攻击和REV - 1对粪胆汁酸水平的影响，涉及细菌产生的BSH;以及它们对SR-B1介导的乳糜微粒分泌的影响，依赖于FXR。与DMSO组或HFD组比较，采用双侧单因素方差分析和Dunnett事后检验评估统计学意义。

文献总结

研究人员将SR-B1和FXR信号纳入对REV-l代谢有益作用的理解。HFD挑战会损害脂质稳态，包括刺激肠道SR-B1表达和提高乳糜微粒分泌。这种损伤与粪便中BAs的升高有关。虽然研究人员证实了CDCA对Caco-2细胞SR-B1表达的刺激作用，但体内FXR/SR-B1的激活可能涉及其他BAs。不同的BAs可作为FXR的激动剂或拮抗剂。REV-l可以靶向肠道微生物组，改善肠道微生物组多样性。REV-l降低了产生BSH的微生物群的密度，这与降低粪便BSH活性有关。这可能有助于降低粪便胆汁酸水平，因为BSH催化水解缀合的胆汁酸盐为去缀合的BAs，包括CDCA。虽然在我们目前的研究中，NF-κB被鉴定为空肠SR-B1的反式激活剂(图5)，并且CDCA可以激活RELA(编码NF-κB)，但胆汁酸(如CDCA)对SR-B1的刺激作用需要FXR。由于体内FXR的激活阻断了REV-l抑制肠道SRB1的作用，我们认为FXR是REV-l调节脂质稳态的关键靶点之一。

doi: 10.1038/s41467-023-38259-1.

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