Tankyrase抑制剂抑制人关节软骨细胞中机械应力诱导的蛋白酶表达

骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，OA 的一个特征是关节软骨的修复和损伤之间的不平衡，其涉及复杂的炎症和代谢因素。尽管在正常软骨细胞中，软骨分化和细胞外基质（ECM）合成代谢促进了软骨修复，但这些功能在 OA 软骨中降低。SRY-box9（SOX9）已被确定为发育中软骨生成的主要转录因子，并通过调节 II 型胶原（COL2A1）和聚集蛋白聚糖（ACAN）来控制 ECM 稳态。然而，OA 软骨中 SOX9 活性也被下调，导致 ECM 合成代谢降低。另一方面，过度的机械应力参与软骨损伤并激活各种炎症途径，如 IL-1β、TNF-α、NF-κB、Wnt、TGF-β 和 microRNA 通路以及氧化应激。过度的机械应力与 OA 有关，并影响软骨结构和软骨细胞的功能。尽管对 OA 的发病机制有这些见解，但目前对 OA 尚无根治性治疗方法。
最近有报道称，端锚聚合酶 Tankyrases（TNKS-1和TNKS-2）是改善病情的骨关节炎药物（DMOADs）的潜在靶点。TNKS-1/2 属于聚（ADP-ribose）聚合酶（PARP）超家族，参与各种细胞和分子过程。PARPs 通过翻译后修饰将 ADP-核糖基团转移至靶蛋白，包括多聚ADP-核糖基化修饰（PARylation）。研究表明，TNKS-1/2 介导的 SOX9 的 PARylation 在调节 SOX9 泛素化和降解中起着至关重要的作用，TNKS-1/2 抑制剂在小鼠 OA 模型中具有软骨保护作用。然而，TNKS-1/2 参与人软骨细胞 OA 发病机制的作用以及 TNKS-1/2 抑制剂在机械应力模型中的软骨保护作用机制仍然知之甚少。
最近，在日本冈山大学医齿药学综合研究科、冈山大学附属病院骨科课题团队的一项研究中，旨在阐明 TNKS-1/2 在 OA 发病机制中的参与，并探讨 TNKS-1/2 抑制剂对机械应力诱导的软骨退变的影响。研究成果发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes”。

首先，实验检测了单轴循环拉伸应变 CTS 刺激（0.5 Hz，10% 伸长率）对正常人软骨细胞的影响。CTS 持续 12h 后，COL2A1、ACAN 和 SOX9 mRNA 水平下降，TNKS-1/2 水平以及 ADAMTS-5 和 MMP-13 水平显著升高。RT-PCR 结果显示，当 CTS 条件更换为 0.5 Hz，8% 伸长率，30min 时抑制合成代谢反应并促进分解代谢反应，此外，TNKS-1/2 水平在 12h 后上调了 3 倍多。因此，随后使用 8% 伸长率进行实验。
然后研究 XAV939（一种 Tankyrase 抑制剂）对 CTS 后 SOX9、COL2A1、ACAN、TNKS-1/2、MMP-13 和 ADAMTS-5 表达水平的影响。XAV939 的浓度确定为 10μM（图1 A），发现 CTS 后 12h，SOX9、COL2A1 和 ACAN 表达水平被 CTS 降低，而这些降低被 XAV939 阻断。在无 CTS 的情况下，受 XAV939 的影响，其表达水平有升高的趋势（图1 B）。在合成代谢反应中，发现 XAV939 消除了 CTS 引起的合成代谢抑制。CTS 后 MMP-13 和 ADAMTS-5 的上调被 XAV939 消除（图1 C）。这表明，XAV939 抑制人软骨细胞的分解代谢作用并促进合成代谢作用。然而，与未加 XAV939 相比，添加 XAV939 的细胞经历 CTS 后 TNKS-1/2 的表达没有显著降低（图1 D）。在未添加 XAV939 的样本中，CTS 后培养基中 IL-1β 的浓度呈时间依赖性增加，CTS 联合 XAV939 处理后 24h IL-1β 的上调显著降低（图1 E）。

图1 TNKS-1/2抑制剂XAV939对CTS诱导的正常人软骨细胞基因表达及上清液中IL-1β浓度的影响。
如前所述，机械应力会激活应激反应信号通路 MAPK。接下来，在CTS 30min 后，在存在和不存在 XAV939 下检测了 MAPK（ERK、p38 和 JNK）的磷酸化。结果表明，与未拉伸组相比，CTS 显著增加了 p38 和 JNK 磷酸化。与对照组相比，ERK2 的磷酸化显著，但 ERK1 没有磷酸化。Western blot 分析显示，XAV939 未抑制 CTS 诱导的 MAPK 磷酸化。
ADAMTS-5 和 MMP-13 表达均在无 XAV939 的 CTS 后上调并定位于细胞质中，而用 XAV939 处理后表达下调（图2 A）。ADAMTS-5 和 MMP-13 阳性软骨细胞的百分比通过 XAV939 处理后显著降低（图2 B）。这些结果表明，XAV939 抑制了 CTS 诱导的 ADAMTS-5 和 MMP-13 表达（图2 C）。
免疫细胞化学显示，CTS 诱导 NF-κB p65 和 β-catenin 易位至细胞核，但这在 XAV939 处理的细胞中被抑制。XAV939 处理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位阳性的软骨细胞百分比显著降低。细胞核提取蛋白的 Western blot 分析结果也表明，XAV939 抑制 CTS 诱导的 NF-κB p65 和 β-catenin 蛋白表达水平。这表明，Wnt/β-catenin 信号激活也发生在机械应力模型中。

图2 TNKS-1/2抑制剂XAV939抑制CTS诱导的正常人软骨细胞中ADAMTS-5和MMP-13蛋白的表达。
免疫细胞化学显示，CTS 后 NF-κB p65 和 β-catenin 同时向细胞核易位，XAV939 可阻断这种作用。XAV939 处理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位的软骨细胞百分比显著降低。在没有 XAV939 的 CTS 样本中，NF-κB p65 易位到细胞核的所有细胞也显示出 β-catenin 的核易位。这一结果表明，NF-κB 和 β-catenin 核易位相互作用，可能影响随后的蛋白酶表达。
最后，研究人员使用患者的18份 OA 软骨样本进行免疫组织化学染色，以评估 TNKS-1/2 在关节软骨中的表达。使用 Mankin 评分评估软骨损伤程度，在软骨退变较低的样本中，TNKS-1/2 很少在每层中表达。在轻度退变的患者中，表层 TNKS-1/2 的表达相对于中层和深层显著增加。在中等退变软骨中，与表层相比，中层和深层的 TNKS-1/2 表达显著增加。尽管与其他等级相比有所下降，但 TNKS-1/2 在重度退变软骨的中层或深层也有表达（图3 A、B）。这表明，TNKS-1/2 在轻度退变的表层中表达明显高于其他层，在中度退变的深层中表达明显高于表层（图3 C）。

图3 TNKS-1/2在人关节软骨组织中的免疫组化评估。
总之，该研究证明了 TNKS-1/2 作为体外正常人软骨细胞机械应力诱导的软骨退变因素的重要性。数据表明，机械刺激上调了 TNKS-1/2 的表达，并且通过激活 Wnt/β-catenin 信号，β-catenin 的核易位可能会增强 NF-κB-IL-1β 信号传导，从而产生 ADAMTS-5 和 MMP-13。研究还发现，TNKS-1/2 抑制剂 XAV939 的干预抑制了这些途径并促进了合成代谢反应。在人 OA 软骨中，与较低和重度 OA 软骨相比，TNKS-1/2 在轻度和中度 OA 软骨中表达更频繁。这些结果提示，TNKS-1/2 可能是 OA 的分子治疗靶点和诊断标志物。
参考文献：Hotta Y, Nishida K, Yoshida A, Nasu Y, Nakahara R, Naniwa S, Shimizu N, Ichikawa C, Lin D, Fujiwara T, Ozaki T. Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2024 Jan 24;25(3):1443. doi: 10.3390/ijms25031443. PMID: 38338721; PMCID: PMC10855100.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38338721/
图片来源：所有图片均来源于参考文献
本文旨在分享、交流生物领域研究进展，关注“Naturethink”公众号，了解更多相关内容。