连登 Nature 子刊！空间转录组技术不仅「出片」，还能发现新靶点

创作有瓶颈，科研人员也有实验瓶颈：

历经数月收集实验室组织切片，常规 H&E 染色获得信息有限，如何兼顾组织结构与基因分析，以发现结构差异或关键靶点？

折腾数周，样本总体蛋白/基因表达水平却无差异，如何进一步检测表征组织局部的表达变化？

又或者，千辛万苦终于锚定感兴趣的基因或细胞，如何进一步探究组织空间定位与亚细胞表达差异？

近年新兴的单细胞空间转录组技术提供了有力武器，让研究找到机制靶点轻而易举，下面让我们一起看看两篇 Nature 子刊发表的研究是如何设计研究思路与应用的。

Nature Communication发表一项创新性研究 Whole-genome sequencing reveals the molecular implications of the stepwise progression of lung adenocarcinoma，研究者对 76 例肺癌样本进行全新的、高精度的空间转录组分析，首先利用基于测序的转录组分析 Visium ，以确定肿瘤样本中基因表达变化的位置；之后利用基于成像的转录组分析 Xenium，进一步放大以精确定位特定的细胞类型。只需两步，即可从病理学和分子生物学的角度阐明肺腺癌的发病机制[1]。同期，另一项研究在线发表 High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell，spatial and in situ analysis，研究利用FFPE 人类乳腺癌切片，对比整合 Visium 和 Xenium 全转录组分析数据，进一步揭示了不同肿瘤区域之间存在的分子差异，发现新的生物标志物与细胞亚型，为乳腺癌的临床诊断治疗提供新的理论依据[2]。

掌握合适的分析方法，发文原来如此简单。文章中使用的转录组分析方法究竟神奇在哪？如何巧妙运用到自己的研究中？

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相辅相成：

Visium HD 和 Xenium 原位分析

基于 NGS 的 Visium HD 空间基因表达分析和基于靶向成像的 Xenium 原位分析是两种互补的空间转录组分析方法。

Visium HD 全转录组分析可用于发现新的靶点或广泛表征感兴趣的组织。Visium HD 是一种基于测序的空间转录组学分析，它采用基于探针的化学方法进行空间上的全转录组分析。将探针与靶点杂交，再与标准载玻片上的组织共孵育。洗掉未结合的探针，然后通过 CytAssist 将结合的探针精确转移到 Visium HD 玻片上（为了最大限度减少扩散来提高空间保真度）。最后利用这些探针生成带有空间条形码的 NGS 文库，以便生成测序读数。（关于 Visium HD 的工作原理，相关资料 3 中有更详细的解释。）

已经确定感兴趣的基因，Xenium 原位分析可进行精确定位。Xenium 是一种基于成像的空间转录组学分析，提供了纳米级的分辨率，可检测整张组织切片上单个细胞中的数百个基因（不久后将达到 5,000 个）。该技术使用了靶向预选基因的锁式探针，与目标基因杂交后，探针通过连接而环化（为靶点特异性增添可信度），通过滚环反应进一步扩增。之后在 Xenium 分析仪上，通过多轮荧光探针杂交、组织成像和探针去除对扩增产物进行检测，产生基于成像的读数。（关于 Xenium 的工作原理，参考资源 4 里有更详细的解释。）

Visium HD 和 Xenium 相辅相成，提供超清晰的生物学图像。

技术规格比较

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多重分析：

全转录组、靶向分析和定制选项

多重分析：单次分析可测定多种 RNA（基因、外源基因、同源异构体等）。每个平台达到的转录本覆盖广度和深度各不相同。为了提供广泛的覆盖率，Visium HD 能够无偏地覆盖整个转录组（约 20,000 个基因），也可以为其他感兴趣的靶点设计定制探针。从而能够广泛表征组织，从头鉴定感兴趣的区域或细胞类型。同时，Xenium 的靶向分析能力，拥有多达 480 个基因的基因组合（即将推出的 Xenium 5K 人类和小鼠基因组合将扩展到 5,000 个基因）。

多重分析比较

查找 Visium HD 定制探针的相关资源[5]。

3

表征灵敏度：

单基因灵敏度、基因检测范围和转录本丰度

灵敏度：用于定义检测转录本的效果如何，可以细分为：单基因灵敏度、基因检测范围和转录本丰度。使用哪个术语取决于作者想要强调哪个具体方面的性能。

单基因检测灵敏度

分析能够检测到的每个基因的转录本数量。这个指标在分析差异基因表达和检测稀有转录本、同源异构体和基因变异等应用中至关重要。再结合基因检测范围（见下文），这个指标有助于确定分析的动态范围。

基因检测范围

您能够在每个细胞或组织区域内检测到多少种不同的转录本，具体取决于单基因灵敏度、多重分析和组织类型。在以发现为重点的应用中，基因检测范围特别重要，例如表征健康或疾病状态下的感兴趣组织。

转录本丰度

每个细胞或组织区域内可检测到的转录本总数。这个指标可用来确定整体基因表达的大范围变化。根据分析方法的单基因灵敏度、基因检测范围、多重分析以及分析的组织总面积计算得出。

灵敏度比较

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选择分辨率：

如何分配转录本以及如何精细地分配？

分辨率：将转录本分配到定义的组织区域或细胞中的某个位置，以观察它们的精细程度。Visium HD 中的转录本被分配到一个小到足以捕获单细胞的区域（图 1A）。考虑到真核细胞的平均大小（介于 10 到 100 µm），每个合并区域可能覆盖不止一个细胞的组分；因此，Visium HD 带来了真正意义上的单细胞分辨率（图 1B）。第三方工具可帮助您对 Visium HD 数据进行数据点解卷积。

图 1A. Visium HD 的捕获区域结构。这张示意图展示了 Visium HD 玻片的布局，带有两个 6.5 x 6.5 mm 的 Visium HD 捕获区域，其中捕获寡核苷酸连续排列在细分为 2 x 2 µm 的正方形单位内。

图 1B. 对 H & E 染色后的人类结肠癌组织的 Visium HD 分析，转录本被分配到 8 x 8 µm 的合并单位内。图中展示了带有无监督基因表达聚类的人类结肠癌缩小图像（左图），以及 8 x 8 µm 单位内的基因表达聚类放大图像（右上图）和 H & E 染色组织放大图像（右下图）。Visium HD 能够分辨 2 x 2 µm 正方形内的转录本，但我们建议以 8 x 8 µm 的合并单位作为起点进行可视化和分析。

Xenium 原位分析将转录本分配到单个细胞中（图 2）。在 Xenium 运行过程中，组织中的每条转录本会被分配 X-Y-Z 轴坐标。之后，在仪器运行过程中进行多模态细胞分割，利用各种形态学染料和专门的人工智能算法来确定各个细胞的边界。

图 2. 利用 Xenium Explorer 对人类肺腺癌进行分析。上图显示的是人类肺腺癌切片的图像，下图显示了 Xenium Explorer 放大后的图像，图中展示了分割的细胞以及定位在单个细胞内的与免疫细胞类型相关的选定转录本。

分辨率比较

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超越基因表达：

利用多组学功能获取更多信息

多组学分析：除了 RNA 之外，还可以测定全套分析物，比如形态、蛋白质等。Visium HD 和 Xenium 都能检测同一张切片的形态（H&E 染色）、蛋白质（免疫荧光 IF 染色）和 RNA 数据。

** Visium HD 测试正在进行中，我们很快会有更多的数据。

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从理论思考到实际问题：

组织类型、样本形式和经费考量等

在试图将新技术整合到实验室中，实用性是关键。组织是整个实验的基础，组织是否固定以及物种来源是决定分析进程的两个重要因素。Xenium 和 Visium HD 分析都与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织兼容，而 Xenium 还与新鲜冷冻组织兼容。

如果是来源于人类或小鼠的 FFPE 组织，那么与任一平台均可兼容。如果是新鲜冷冻组织，可与 Xenium 分析兼容，在即将发布的示范方案中，这一兼容功能将扩展到 Visium HD。如果您研究的物种既非人类又非小鼠，Xenium 可通过高级定制设计选项与任何物种兼容，而 Visium HD 可与非人类灵长动物或大鼠兼容（6）。

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样本数量、组织大小和时间限制

对于任何技术而言，样本越多，耗时越长。然而，这一普遍规律有两个主要差别。首先，额外花费的时间并不一定因每个额外样本呈线性增加。其次，组织样本在捕获区（Visium HD）或成像区（Xenium）的排列方式多种多样——一张载玻片可以容纳一个大样本、几个中等样本或多个小样本（图 3）。因此，从运行的玻片数量（而非严格意义上的分析样本数）来考虑这些技术更有意义。

图 3. Visium HD 和 Xenium 载玻片上的组织放置方式示例。Visium HD（上图）或 Xenium（下图）的单次运行可根据各种不同的组织配置来优化，包括（但不限于）单块大切片和组织芯片，具体取决于实验的需求。

作为一种基于 NGS 的技术，每次 Visium HD 运行的输出结果是一个测序文库。因此，在 Visium 分析时，可以通过批量处理大量样本的测序文库来扩大规模。Visium HD 工作流程本身大约需要 2～3 天，其中手动操作约 8 小时。对基于成像的 Xenium 来说，组织分析时间和通量随分析的组织总面积和分析多重性而定。在利用 480 重基因组合分析总面积为 4 cm2 的组织（使用多模态细胞分割）时，预计手动操作时间为 6 小时，图像采集前的准备时间为 2～3 天。

划重点

建议估算每个组织样本的大小，以此来确定每种技术需要运行的玻片总数，并确定大致的分析总时间。

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数据分析方法

Xenium 原位分析和 Visium HD 分析的数据最终分别以基于成像和测序的形式输出。两个平台都提供了直观的数据可视化和分析流程，并与第三方工具轻松兼容。在 Visium 文库测序完成后，通过 Space Ranger 分析流程运行数据。这些输出结果（包括但不限于特征条形码矩阵（h5）和组织位置（parquet）等文件格式）可通过 Loupe Browser 进行可视化，并对 Visium 聚类进行差异分析和再聚类（图 4）。

图 4. Loupe Browser 中的 Visium HD 数据可视化示例。可视化结果呈现了 E17 小鼠胚胎中转录本的表达分布。Xenium 数据的机载分析与图像采集和分析步骤同步进行，因此在运行结束后会立即生成可解释的数据，具体格式包括 ome.tiff（图像）、.parquet、.zarr 和.csv（转录本）。这些输出结果可通过 Xenium Explorer 进行可视化（图 5）。

图 5. Xenium Explorer 中的 Xenium 数据可视化范例。可视化结果呈现了利用 Xenium 人类多种组织和癌症基因组合分析的 FFPE 人类肺癌组织。我们深知一些使用案例也很重要，但超出了我们提供的软件解决方案的范围，因此我们确保这两个平台都能以多种常见的开源文件格式提供数据输出，方便使用第三方工具进行分析。Visium（7）和 Xenium 分析指南（8）中列举了目前可用的第三方工具。

划重点

Xenium 和 Visium HD 都具有全面且直观的数据可视化和分析流程、支持多种开放格式的文件输出、轻松兼容第三方分析工具。

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向空间分析迈出下一步

这两种技术都能实现前所未有的清晰度、深度和广度来观察组织。本篇文章是两种技术的要点总结，希望对大家的研究有所帮助。如果想更深入了解每种方法的优势。欢迎跳转到 Visium HD（9）和 Xenium 页面（10），了解更多信息！

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内容审核：潘成
项目审核：朱超敏

图片来源：10x Genomics

题图来源：10x Genomics

文章来源：10x Genomics

参考资料

[1].Haga Y, Sakamoto Y, Kajiya K, et al. Whole-genome sequencing reveals the molecular implications of the stepwise progression of lung adenocarcinoma. Nat Commun. 2023 Dec 15;14(1):8375. doi: 10.1038/s41467-023-43732-y.

[2].Janesick A, Shelansky R, Gottscho AD, et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 2023 Dec 19;14(1):8353. doi: 10.1038/s41467-023-43458-x.

[3].https://www.10xgenomics.com/cn/products/visium-hd-spatial-gene-expression

[4].https://www.10xgenomics.com/in-situ-technology#how-it-works

[5].https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression-flex/documentation/steps/experimental-design-and-planning/custom-probe-design-for-visium-spatial-gene-expression-and-chromium-single-cell-gene-expression-flex

[6].https://www.10xgenomics.com/support/in-situ-gene-expression/documentation/steps/panel-design/species-standalone-custom-and-advanced-custom-panel-design-for-xenium-in-situ

[7].https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/continuing-your-journey-after-running-space-ranger

[8].https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/continuing-your-journey-after-xenium-analyzer

[9].https://www.10xgenomics.com/cn/products/visium-hd-spatial-gene-expression

[10].https://www.10xgenomics.com/cn/platforms/xenium