WB,一个科研界的「神级」实验,拥有着非常独特的品质:神秘、强大、有影响力。
神秘:漂亮的 WB 条带就像鬼,人人都说有但是从来没人在实验室里见过。
强大:很难被实验技巧所干预,身经百战的科研老司机也会遭遇 WB 的背刺!
有影响力:影响范围极其广泛,从研一到博后,甚至导师面对之,也会望而却步。
一次 WB 至少 36 个小时,曝光条带「开盲盒」的时候,映入眼帘的往往是:脏背景、信号弱、大气泡、歪条带,甚至没条带.......
学霸君为大家整理了 6 个异常条带的原因以及修正策略。
文末还附上了科研人 WB 专项训练,一周跟练,让你的 WB 得到质的提升。
脏脏带 —— 高背景条带
来源:丁香实验
高背景是 WB 中最常见的问题之一,它会严重干扰条带的辨识。看着丑、ImageJ 也分析不出来,基本等于无用条带。拿到它也就证明你浪费了宝贵的 36 小时。
可能原因 & 对策:
洗涤可能不充分:使用含 Tween-20 的 PBST 作为洗涤液,增加洗涤次数至 3-5 次,每次 5 分钟。
封闭不充分:尝试使用 BSA 或其他低内毒素封闭液替代牛奶,减少非特异性结合。
抗体本身问题:实验前对一抗进行预吸附处理,去除可能的交叉反应成分。* 选用纯化抗原、过表达裂解物或同源蛋白填充柱/管,加入一抗孵育后离心或过滤,弃去溶液保留抗体,以此减少 WB 非特异性结合。
弯弯带 —— 偏移条带
来源:丁香实验
有时,曝光后会突然出现凹凸不平或者偏移的条带。这些条带位置不准确的情况,常见于科研小白(或者让小白帮你配胶的科研大佬)因为这些条带很可能是胶引起的。
可能原因 & 对策:
凝胶聚合不均匀:灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓。(见文末专项训练)
分离胶凝固问题:凝固时可用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面,阻断空气,分隔线会更加平直,也会减少 「微笑」 或 「倒微笑」 等弯弯条带的出现。
胶板底部有气泡:这些气泡会影响电泳效果,开始电泳前应倾斜电泳装置,赶走气泡。
淡淡带 —— 很淡很淡的条带
来源:丁香实验
这种杂交信号很弱的条带往往出自老司机之手,并非操作问题,而是蛋白量、抗体量、转膜时间估算出现了问题。(不提前计算好时间、细节而盲目自信导致的)。
很可惜!这类条带虽然能看出趋势,但是对于数据统计和文章发表来说依旧不够标准。
可能原因 & 对策:
蛋白量太少:可以适当增加蛋白上样量(通常一孔 20-100μg 总蛋白)
抗体效价太低:可以适当加大抗体浓度,或者更换其他抗体过度漂洗膜:这也可能会导致信号变弱、条带太浅;
转移到膜上的蛋白太少:当蛋白分子量 <10 KD 时,可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。
粘连带 —— 连在一起的条带
来源:丁香实验
条带连在一起,通常意味着实验中存在一些「技术问题」,这样的条带降低了分辨率,不同孔的蛋白条带无法清晰区分,基本无法统计。
以下是可能的原因及相应的对策:
可能原因 & 对策:
上样量过大:减少上样量至推荐范围(通常 20-100μg 总蛋白),可先尝试减半上样量。
一抗孵育时间过长:缩短一抗孵育时间,一般 4°C 过夜较为合适,或按抗体说明书推荐时间执行。
加样孔残留胶:拔梳子后彻底冲洗并吸干加样孔,避免胶残留导致扩散。
上样速度慢导致扩散:快速且均匀地上样,减少样品在孔口的停留时间。
APS(过硫酸铵)长时间存放:确保每次使用新配制的 APS,避免因降解导致的问题。
装板不紧密:确保电泳胶与膜、膜与滤纸间装配紧密,减少漏电。
点点带 —— 出现黑点的模糊条带
来源:丁香实验
这类条带的出现,可能与多种操作问题相关,包括抗体、转膜、操作污染,需要一一排查。
可能原因 & 对策:
抗体沉淀:抗体使用前充分混匀并短暂离心,避免抗体颗粒形成。ECL 试剂不均:确保 ECL 试剂新鲜并均匀涂抹,可轻轻摇晃混合后再使用。
膜过于干燥:在操作过程中保持膜湿润,避免膜在空气中暴露过久。抗体稀释液问题:使用无菌、无颗粒的 PBS 或 TBST 稀释抗体,确保溶液干净。
膜质量问题:更换高质量 PVDF 或 NC 膜,避免使用劣质或破损的膜。
操作污染:实验全程戴手套,使用无菌操作,避免灰尘和异物落入。
泡泡带 —— 出现气泡、杂质的条带
来源:丁香实验
很多人认为泡泡带一定是转膜时产生气泡,但其实还可能有以下问题。
可能原因 & 对策:
转膜时产生气泡:转膜前用缓冲液预湿膜,转膜时缓慢放下,用吸水纸轻压排出气泡。
电泳胶不平整:确保凝胶和电泳槽底部贴合紧密,使用夹子固定,防止气泡生成。
样品含有颗粒:使用超声波破碎或过滤样品,去除颗粒物,确保样品纯净。
封闭不充分:适当延长封闭时间,使用足够的封闭液量,确保膜全面覆盖。
没有带 —— 我条带呢?
来源:丁香实验
最后,很多同学可能会经历没有条带的 WB 条带,遇到这种问题可先别想着重新做实验,把条带丢掉,其实你的条带可能还有救。
可能原因 & 对策:
抗体失效:验证抗体活性,更换新批次抗体再试一次,如仍没有条带可能是以下问题。
电泳或转膜失败:检查电泳缓冲液、凝胶浓度和转膜时间,确保电泳和转膜过程正常。
样品降解:使用蛋白酶抑制剂,快速冷冻样品,防止蛋白在提取和处理过程中降解。
膜过度清洗:减少洗涤次数或缩短每次洗涤时间,避免过度清洗导致信号减弱。
以上就是 6 个异常条带的原因以及修正策略,掌握了上述策略,下一步就是将其转化为实际操作的肌肉记忆啦。
学霸君为你设计了更具挑战性和实用性的专项练习,快收藏本文,一起进步吧!
最后,请查收 WB 人一周专项训练,跟着学霸君练起来!
周一:配胶 *3 板(8%、10%、12%),锻炼手部稳定性
周二:挑出最佳胶板跑胶 *1 次,计算电压并记录时间
周三:自己转膜 *1 次;临摹师兄师姐转膜 *1 次
周四:1 分钟速度叠船 *10 只(各种尺寸大小)
周五:休息日,检查实验笔记并复盘。
相信我,连续坚持 3 周下来,你的 WB 也可以有质的提升。
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