结合谱系信息和基因表达，了解蓝鳍金枪鱼对后代存活的分子机制

<<——【·前言·】——>>

许多鱼类物种的早期生命阶段都表现出较高的死亡率。这些鱼类的繁殖力通常很大，它们通常通过大规模产卵来传播它们的卵子。

在养殖这些高繁殖力的鱼类时，将它们随意地在单个水槽或笼子中进行大规模产卵是一种常见的做法。

这种繁殖策略经常会导致后代中家庭结构严重不平衡，许多水产养殖物种的基于遗传标记的亲权分析已经揭示出这一点，因此可能导致高风险的迅速基因丧失。

在一个极端案例中，涉及到日本比目鱼，在六只雄性中的一个同龄群体中，来自大规模产卵事件的幼鱼中有超过99%是由一个雄性所产生的。

高度不同的家庭生存的原因似乎因物种而异，受到发育阶段、饲料配方、水产养殖设施和环境因素的影响。

更好地理解不同家庭生存背后的机制将为改善水产养殖的育种技术提供宝贵的信息。

一、基因表达自然变异的遗传基础

自酵母到人类，包括鱼类在内的生物体中都存在基因表达自然变异的遗传基础。这种表型特征，即基因表达表型，还表现出家族聚集性和遗传成分。

因此，将家谱信息与基因表达表型联系起来，可能有助于理解水产养殖物种幼鱼培育中不同家庭生存差异的分子机制。

为了验证这一假设，本研究调查了太平洋蓝鳍金枪鱼早期阶段在大规模培养箱中的存活情况和基因表达表型上的亲本效应。

尽管在2002年，日本近畿大学成功开展了PBT的全生命周期养殖，但PBT早期幼鱼培育中仍然存在严重的死亡现象。

我们首先对来自一个产仔群体的PBT后代进行了家系和家族代表性的调查，分别在出壳后1天、10天、15天和40天时在大规模培养箱中进行。

在出壳后15天后，家族代表性发生了显著的比例变化，我们使用之前开发的44KPBT寡核苷酸微阵列对出壳后15天的幼鱼进行了转录组分析。

分析成功地揭示了基因表达表型引起不同家庭存活差异的原因。总共有44.4×10^4尾出壳后1天的幼鱼被转移到了一个50千升的大规模培养箱中。

孵化箱内的存活率在出壳后15天降至22.1%。最终，在出壳后40天时，存活率降至0.5%。总共有376条后代成功地被分配到它们的亲本。

由7个雌性和10个雄性产生了14个同父母的家庭。尽管在出壳后1天时家庭规模不均等，但在出壳后15天后家庭规模差异显著增大。

特别是，♀412在出壳后1天和10天是最大的母本贡献者，但在出壳后15天和40天其贡献大幅减少。

相反，♀262的贡献要低得多，相对于出壳后1天和10天的♀412，但在出壳后15天和40天其贡献大幅增加。

♀262♀202和♀412♂202两个家庭共享相同的父亲，在出壳后40天时，♀262♂202的比例比♀412♂202高7倍。

因此，这些结果表明，母本对出壳后的存活影响大于雄性，母本♀262对后代在发育过程中的存活能力有很强的正面影响。

在♀412的母本家庭中，也观察到了♂202的父本效应，其贡献从1天到40天几乎没有变化，而该母本系中的其他同胞♂297从1天到40天和♂387从1天到40天都大幅减少。

由于在出壳后15天后观察到家庭代表性发生了相当大的变化，因此进行了出壳后15天的PBT幼鱼转录组分析。

根据亲本评估，我们选择了四个同父母的家庭，♀262♂202，♀262♂432，♀412♂387和♀412♂202进行转录组分析。

分层聚类热图清晰地显示了具有5739个差异表达基因的家庭特异性基因表达模式。特别是，基因表达模式按母本分为两个大类：♀262和♀412。

因此，这些结果表明，父母对后代的基因表达表现出亲本效应，与15天后的父本效应相比，母本效应更强。

与♀262配偶的家庭和♀412♂387家庭中高表达的酸分泌相关基因ATP4A和ATP4B以及胃蛋白酶基因PG1、PG2和PG3，与♀412♂202家庭相比，差异超过10倍。

这些结果通过逆转录-定量聚合酶链反应得到确认。ATP4A和ATP4B是H/K-ATP酶的亚基，它是胃质子泵，有助于胃酸水解食物所需的酸性环境。

相反，在♀262-dammed家庭和♀412♂387中，两个潜在的胃标志基因，黏蛋白-5AC和IgG结合蛋白的Fc片段。

MUC5AC是胃黏液层的主要成分，而FCGBP在功能上与形成凝胶黏液相关，并且是黄尾鱼胃中高表达的基因。

此外，两种溶质载体超家族基因和一种胰蛋白酶原——胰蛋白酶的前体，在♀262的家庭和♀412♂387中高表达。

胰蛋白酶是一种蛋白质水解酶，在鱼类幼仔的消化能力中发挥着重要作用，而SLC超家族基因编码一系列在养分和离子吸收中起重要作用的转运体。

值得注意的是，小鼠的SLC26A9在胃中丰富表达，是胃表面上皮细胞中顶端的HCO3-转运体，起着保护胃上皮免受酸性损伤的重要作用。

相反，♀412的母系家族高度表达了与免疫相关的基因，包括GTP酶IMAP家族成员，穿孔素，葡萄糖依赖性胰岛素增生受体，Toll样受体13和B细胞受体CD22。

还应注意，♀412的母系家族高度表达了与转座元件相关的基因，我们还研究了♀412♂202中高度表达的基因。

与♀262♂202、♀262♂432和♀412♂387进行比较，并鉴定出了八个候选基因。其中八个基因中有五个在免疫系统中也具有潜在功能。

包括GIMP7、免疫相关核苷酸结合蛋白13、热休克蛋白30、半胱氨酸蛋白酶1和E3泛素蛋白连接酶RNF144A-A。

二、PBT幼虫在鱼幼虫初始摄食过程中的影响

从1到40DPH的PBT幼虫发育过程中观察到家庭代表性比例发生显著变化，母系的影响效应明显，尤其是从10到15DPH。

这些结果表明，可能发生了一些关键事件，这些事件影响了大约15DPH左右的幼鱼存活，特别是♀262的增加和♀412的下降后代。

15DPH幼鱼的转录组分析清楚地表明，基因表达表型与其父母的遗传结构密切相关，与父系的影响相比，母系的影响更大，这是根据亲权评估所预期的。

发现得到了通过使用所有基因型化的幼虫对PG2进行的qRT-PCR分析的强有力支持。基因表达强度与家庭存活呈正相关，并且在♀262的母系家族中明显高于♀412的母系家族。

虽然寡核苷酸芯片结果显示了♀412♂387中PG2基因表达水平较高，但qRT-PCR结果没有突出显示♀412♂387和♀412♂202家族之间的任何统计学差异。

♀412♂387家族在1到40DPH之间急剧下降，并且大多数幼鱼在40DPH之前就死亡了。因此，这些结果可能会因剩余幸存者的存在而产生偏倚，因为这些基因的表达较高。

在15DPH阶段，幼鱼处于后屈曲阶段，胃腺开始形成，胃蛋白酶活性迅速增加。值得注意的是，在先前的PBT早期发育阶段的转录组分析中，已经观察到与胃功能相关的基因。

胃质子泵，胃蛋白酶原以及潜在的胃标志物在13到15DPH之间显著增加，这表明了这些基因在15DPH时的重要性。

观察到明显的生长差异，这与捕食行为的开始时间以及卵黄囊鱼苗的使用有关。这种生长差异导致了生长选择性死亡，即立即利用鱼苗的PBT幼鱼生长迅速并在孵化池中存活。

这些发现表明，捕食行为是15DPH左右幼鱼生存的关键事件。这项研究强烈暗示，这一阶段胃功能的开始对于消化大型猎物非常重要。

这会影响随后的幼鱼存活，并受到父母基因背景的影响。另一方面，Sabate等人报告称，PBT幼鱼的追逐行为，与食肉行为密切相关。

首次在屈曲到后屈曲阶段的14DPH时观察到，并在此后增加，具有发育较好的胃功能的PBT幼鱼有能力对相对发育不足的幼鱼进行食肉攻击，然后引发选择性死亡是可能的。

在15DPH时，♀412的家庭中表达较高的免疫和可移动元素相关基因多于♀262的家庭。另外，♀412♂202专门表达了五个免疫相关基因。

真核基因组中的可移动元素也被报道受到应激的激活，触发天然免疫反应。因此，免疫功能的调节在♀412的家庭中可能更为活跃。

免疫功能对存活能力产生负面影响的可能原因可以通过免疫和竞争性生理功能之间的权衡来解释。

免疫功能是一种耗能的生理活动，因此分配给胃功能的能量在♀412的家庭中可能较低。另一个可能性是，过度激活的免疫功能可能提高了存活率，弥补了胃功能障碍。

尤其是在♀412♂202家庭中，在本研究中，它在40天内保持了自己的大小。酸性的胃环境可以杀灭摄入的微生物，而它们可以在无胃鱼类的肠道中存活。

因此，胃功能障碍的幼仔可能会在其消化道中遭受机会性细菌感染，因为肠道上皮是病原体入侵的潜在通道。

过度激活的免疫功能可能会减轻胃功能障碍幼仔的细菌感染。由于对金枪鱼幼仔的微生物组知之甚少，需要进一步研究肠道微生物组与太平洋蓝鳍金枪鱼幼仔的存活之间的关系。

本研究表明，在太平洋蓝鳍金枪鱼幼仔在养殖池中进行鱼类幼仔的初始喂养期间，胃部的功能发育对于其在孵化池中的随后存活至关重要。

此外，在这一发育阶段，胃功能相关基因的表达水平可能有助于区分低和高死亡率的家庭。最近，利用高通量测序技术的RNA-Seq已经被开发成为转录组分析的方法。

与微阵列技术不同，RNA-Seq可以应用于没有基因组资源的非模式生物。因此，尽管我们的研究侧重于太平洋蓝鳍金枪鱼幼仔的养殖并使用了微阵列平台。

但这里突出的策略可以扩展到水产养殖中感兴趣的物种，以寻找了解与不同家庭存活相关的分子机制的线索。这些信息可能有助于优化水产养殖业的育种技术。

三、总结

在鱼类养殖中，大规模产卵往往会导致家庭规模的显著差异，这可能会导致育种增强种群的种子生产中有效种群规模的降低。

本研究报告了一个综合利用家谱信息和基因表达表型的示例，以了解太平洋蓝鳍金枪鱼早期阶段在养殖池中不同家庭存活机制。

在孵化后的1、10、15和40天，使用部分线粒体DNA控制区序列和11个微卫星位点确定亲本关系。在约15天时，家庭比例发生了显著变化。

因此，使用先前开发的寡核苷酸微阵列对15天的幼仔进行了转录组分析。这个分析成功地解决了家庭特定的基因表达表型，涉及5739个不同ially表达的基因。

突出了发育阶段胃功能相关基因的表达水平对于随后的存活的重要性。这里展示的策略可以广泛应用于水产养殖中感兴趣的物种。

以了解亲本对后代存活的分子机制，从而有助于育种技术的优化。