中科院1区-广中医等揭示七叶苷激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡治疗肝纤维化

肝纤维化（LF）在慢性肝病发展为肝硬化的过程中发挥着至关重要的作用，抑制肝星状细胞（HSC）活化被认为是预防LF的有效途径。七叶甙是一种羟基香豆素，它通常存在于许多药用植物中，包括七叶树、菊苣、白蜡树的树皮中，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗菌特性。已有研究报道七叶苷在肝脏疾病治疗中的潜力。然而，目前尚无关于使用七叶苷治疗肝纤维化的研究。

2024年2月17日，广州中医药大学中药学院侯少贞教授团队在Phytomedicine（IF=7.9）上发表题为“Esculin inhibits hepatic stellate cell activation and CCl4-induced liver fibrosis by activating the Nrf2/GPX4 signaling pathway”的文章，发现七叶苷显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化，降低CCl 4诱导小鼠的促炎因子、氧化应激和肝脏 Fe 2+的水平，抑制TGF-β1 诱导的LX-2细胞活化，并降低α-SMA和 I 型胶原蛋白的表达。机制上，机制实验证明七叶苷能够激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝铁死亡，而用Nrf2抑制剂（ML385）处理LX-2细胞时，七叶苷的治疗效果显著下降。

1、七叶苷改善CCl4所致小鼠肝损伤

采用腹腔注射CCl4诱导C57BL/6J小鼠LF模型，发现与对照小鼠相比，CCL4诱导的小鼠体重明显减轻，而经Esculin和SMT（水飞蓟宾葡甲胺片，阳性对照）处理的小鼠体重减轻明显改善，且小鼠的肝脏沉积和肝脏系数明显降低。此外，Esculin干预后均表现出剂量依赖性改善血清AST、ALT等血清标志物，说明Esculin可以改善CCL4诱导小鼠肝损伤。

图1 七叶苷改善CCl4所致小鼠肝损伤

2、七叶苷改善CCl4所致小鼠肝纤维化

接着作者评估了七叶苷对CCl4所致小鼠肝纤维化的影响，发现用Esculin治疗后纤维化标志物（血清HA，PC III和LN）水平呈剂量依赖性下降。此外，肝组织病理分析显示七叶苷治疗可改善肝组织炎症和脂质空泡化，减少胶原和纤维沉积，降低α-SMA和胶原I的表达。这些研究结果表明，七叶苷可以改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。

图2 七叶苷改善CCl4所致小鼠肝纤维化

3、七叶苷对CCl4处理小鼠炎症和氧化应激诱导的铁死亡的影响

研究表明，氧化应激和炎症因子是肝损伤发展的主要致病机制，且肝纤维化与铁代谢紊乱和脂质过氧化物积累密切相关。作者发现Esculin治疗显著降低炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平并改善MDA和SOD的水平。此外，模型组在造模后肝脏中Fe2+水平显著升高，而Esculin处理后下降。免疫荧光显示CCl4诱导后肝组织中Nrf2和GPX4的表达显著降低，而七叶苷治疗增加了肝细胞中Nrf2和GPX4的表达。结果表明Esculin通过激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝脏铁死亡，发挥抗氧化和抗炎作用。

图3 七叶苷对 CCl4 处理小鼠炎症和氧化应激诱导的铁死亡的影响

4、七叶苷抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化

为了研究Esculin对HSC活化的影响，使用TGF-β1诱导LX-2细胞活化，并用不同浓度的Esculin处理。发现Esculin干预后，LX-2细胞形态恢复到更正常的状态，细胞增殖速率下降。此外，免疫荧光染色、WB、PCR显示Esculin处理导致α-SMA和胶原蛋白I的表达呈剂量依赖性降低，结果表明Esculin具有抑制HSC活化的能力。

图4 七叶苷抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化

5、七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡

GPX4是参与铁死亡的重要靶基因，受Nrf2信号通路调控，在肝脏疾病的发生发展中起重要作用。作者发现Esculin处理后，Nrf2、HO-1、NQO-1和GPX4的水平呈剂量依赖性增加，免疫荧光染色结果显示Esculin促进Nrf2易位进入细胞核，激活Nrf2/GPX4通路，导致GPX4表达增强，抑制铁死亡。结果表明Esculin激活LX-2细胞中的Nrf2/GPX4信号通路。

图5 七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡

6、七叶苷抑制LX-2细胞活化的作用取决于Nrf2介导的铁死亡

为了验证Nrf2/GPX4信号通路是否是Esculin抑制HSCs活化的关键通路，作者使用Nrf2抑制剂（ML385）抑制LX-2细胞中Nrf2的转录，发现加入ML385后，Esculin组的LX-2细胞迅速扩增和增殖，添加七叶苷组的α-SMA和胶原蛋白I在添加ML385后显著升高，表明ML385可以减弱Esculin对HSC活化的抑制作用。此外，添加ML385后，Nrf2和GPX4在LX-2细胞中的表达水平显著降低，最后，分子对接、DARTS、CETSA结果显示Esculin与Nrf2之稳定结合。结果表明Esculin可以靶向Nrf2/GPX4信号通路，抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化。

图6 七叶苷抑制 LX-2 细胞活化的作用取决于 Nrf2 介导的铁死亡

总结

该研究利用CCl 4诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β1诱导的LX-2细胞模型，证明七叶苷是一种潜在的治疗肝纤维化的天然活性成分，可以抑制肝星状细胞（HSC）的活化，改善肝纤维化，机制实验证明七叶苷的治疗作用是由于其能够激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝铁死亡。

图7 七叶苷激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡治疗肝纤维化

参考文献

Xu S, Chen Y, Miao J, Li Y, Liu J, Zhang J, Liang J, Chen S, Hou S. Esculin inhibits hepatic stellate cell activation and CCl4-induced liver fibrosis by activating the Nrf2/GPX4 signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Jun;128:155465. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155465. Epub 2024 Feb 17. PMID: 38471319.

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