Nature | 转座酶辅助下的高效植物基因组整合技术—TATSI

署名 | 静思

植物转基因技术已经被广泛用于基础研究和作物改良，传统的转基因整合发生在基因组中的位置被认为是随机事件，可能引起意外的突变或存在位置效应，所以实现特异性靶位点的基因组整合需求急迫【1,2】。目前有多种方法可以实现特定位置的转基因插入，如同源重组技术（HR），但是HR在植物中的效率低下，一直未有较大突破【3】；可编程核酸酶系统如CRISPR-Cas的出现，提高了靶向整合的能力，但是也存在插入片段较小，概率低下的问题【4】。II类DNA转座子（TE）编码转座酶蛋白，可以从供体位置切除相应DNA，并将其准确地插入基因组中新的整合位点【5】。前期报道，利用蓝藻中CRISPR相关转座酶实现了大肠杆菌中的高效靶向基因整合【6-8】。但是在植物中实现高效基因组定向整合仍然面临挑战。

近日，美国密苏里大学R. Keith Slotkin和南卡罗来纳大学C. Nathan Hancock团队合作在Nature上发表了题为“Transposase-assisted target-site integration for efficient plant genome engineering”的研究论文，开发出了植物转座酶辅助靶点整合（Transposase-Assisted Target-Site Integration, TATSI）系统，在植物基因组中实现了高效的靶向插入。

在该研究中，作者受细菌中CRISPR相关转座酶靶向可编程区域的启发，将水稻来源的Pong转座酶蛋白与可编程核酸酶Cas9和Cas12a融合表达，在前期构建的拟南芥转基因株系中进行功能验证，经过两步转化和基因型鉴定，证明了不同的核酸酶可以与Pong转座酶蛋白结合来进行靶向整合。为了判断基因整合过程中，水稻转座子基因mPing到靶标位点PDS3基因靶向的准确性，研究人员对该事件进行了深度扩增子测序分析，数据显示，mPing在靶向插入后是完整的，插入后mPing和靶位点DNA交界处的碱基上出现了小的缺失，这些小的缺失可能是由非同源末端连接（NHEJ）在修复整合连接过程中引起的。为了研究除了CRISPR-Cas靶位点外，mPing插入是否发生在基因组的其他区域，研究人员进行了插入测序（insertion-seq），以鉴定拟南芥基因组中所有的水稻mPing插入位点，分析结果说明，在PDS3以外的其他位置的mPing插入是由活跃的mPing转座系统产生的自由转座事件，而不是CRISPR-Cas9非特异性切割的位点。随后，进一步探究TATSI的可编程性，作者证实了该系统可以实现多个位点的同时靶向整合，但是未能检测到靶位点发生甲基化事件，作者猜测靶位点没能实现甲基化的原因可能是所用TE为外源，而此次转座事件是非自主的。研究人员进一步评估了TATSI靶向整合的效率，在拟南芥中，使用单组分系统进行靶向插入的效率可以达到35.5%，与其他类型的基因组整合技术比较后分析发现，TATSI较高的靶向效率可能是由于染色体外mPing元件的转座酶结合的原因。随后，作者探究了TATSI可以靶向整合片段大小的能力，实验结果证明：标准的mPing元件（430bp），含有六个热休克元件（HSEs）的mPing_HSE元件（444bp），含有bar基因编码区的mPing_bar_CDS元件(1002bp)，含有bar基因表达盒（包括启动子和终止子）的mPing_bar元件(1563bp)，较大的mPing_EPSPS元件(8.6kb)都可以通过TATSI系统成功实现靶向插入，但是携带越小的货物靶向插入效率越高。最后作者在大豆中实现了高达18.2%的靶向插入效率，证明TATSI系统拥有广阔的商业应用价值。

综上所述，该研究利用了TE的自然转移能力，共表达水稻Pang DNA转座子系统和Cas9/Cas12a，开发出TATSI系统，实现了模式植物拟南芥和农作物大豆高效靶向整合，显著提高植物基因组编辑的效率和准确度，为作物性状改良和新品种培育提供了优良的工具。

参考文献：

1. Tzfira, T. & Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biolopgy and biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 147-154 (2006).

2. Peterson, D. et al. Advances in Agrobacterium high-frequency targeted gene insertion in maize. transformation and vector design result in Plant Biotechnol. J. 19, 2000–2010 (2021).

3. Anand, A. et al. High efficiency Agrobacterium-mediated site-specific gene integration in maize utilizing the FLP-FRT recombination system. Plant Biotechnol. J. 17, 1636–1645 (2019).

4. Zong, Y. et al. An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants. Nat. Biotechnol. 40, 1394–1402 (2022).

5. Muñoz-López, M. & García-Pérez, J. L. DNA transposons: nature and applications in genomics. Curr. Genomics 11, 115–128 (2010).

6. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019).

7. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR-Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019).

8. Tou, C. J., Orr, B. & Kleinstiver, B. P. Precise cut-and-paste DNA insertion using engineered type V-K CRISPR-associated transposases. Nat. Biotechnol. 41, 968–979 (2023).

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07613-8