北京
枯草芽孢杆菌（
Bacillus subtilis）是一类细长杆状、内生孢子的革兰氏阳性细菌，本身可产生多种具有良好广谱抑菌性、稳定性和安全性的抑菌物质， 在食品防腐保鲜方面发挥着重要作用 。 随着计算机技术和生物信息学技术的飞速发展，高通量测序技术在微生物基因组中得到广泛应用，使人们能准确、高效解析微生物基因组信息，进而更好挖掘微生物功能及其作用机制。
沈阳农业大学食品学院的纪帅奇、乌日娜、武俊瑞*等对从豆酱中分离的1 株具有优良抑菌特性的枯草芽孢杆菌SNBS-3进行全基因组测序，获得基因组信息的同时，结合直系同源集（COG）、基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、碳水化合物活性酶（CAZyme）、抗生素耐药性数据库（CARD）和致病毒力因子数据库（VFDB）等，详细地解析基因组和菌株次级产物信息，应用AntiSMASH和Bagel4软件发现枯草芽孢杆菌SNBS-3具有完整合成细菌素的基因簇，结合抑菌实验和蛋白酶实验结果验证该菌具有合成细菌素的能力。旨在更好地为开发枯草芽孢杆菌SNBS-3提供生物信息基础。
1 枯草芽孢杆菌的体外抑菌效果
由图1可知，枯草芽孢杆菌上清液中的抑菌物质对6 种指示菌均有影响，其中对革兰氏阳性菌的抑制效果比革兰氏阴性菌效果更好，对金黄色葡萄球菌抑制效果最好。
2 蛋白酶对枯草芽孢杆菌上清液抑菌能力的影响
由表1可知，枯草芽孢杆菌SNBS-3上清液经过蛋白酶K处理前后对6 种指示菌的抑制能力下降较大，均超过50%，说明上清液含有的抑菌物质为蛋白质或肽类。
3 基因组组成与信息
由图2可知，枯草芽孢杆菌SNBS-3的基因组为一条环状闭合DNA，大小为4 076 387 bp，共预测到4 000 个蛋白质编码基因、86 个tRNA基因、30 个rRNA基因、91 个sRNA。由图3可知，基因平均长度为897.02 bp，最短基因长度为90 bp，最长基因长度为16 545 bp，长度大于等于500 bp的基因有2 815 个，长度大于等于1 000 bp的基因有1 328 个；串联重复序列为34 个，重复比例为0.8%；散在重复序列为35 个，重复比例为0.07%。
4 基因功能注释
4.1 COG数据库注释
将菌株SNBS-3基因组中的蛋白编码基因在COG数据库注释，共有3 209 个蛋白质编码基因得到注释，结果如图4所示。由图4可知，注释结果共有20 类，分别有1、172、34、302、80、255、103、97、159、260、124、196、39、103、196、67、859、127、32、54 个基因注释分类到B～V。其中未知功能基因最多，共859 个，占注释基因总数的26.77%，接下来注释基因数量较多的功能分类依次：氨基酸转运与代谢（E）302 个（占比9.41%）、转录（K）260 个（占比8.1%）、碳水化合物运输和代谢（G）255 个（占比7.95%）、细胞壁/细胞膜/细胞被膜（M）和无机离子的转运与代谢（P）各占196 个（占比6.11%）。
4.2 GO数据库注释
将菌株SNBS-3基因组中的氨基酸序列与GO数据库进行比对分析，共有2 824 个功能基因得到注释，结果如图5所示。由图5可知，2 258、1 645 个和1 638 个功能基因分别注释到分子功能、生物过程和细胞组分。在分子功能中，分类到ATP结合和DNA结合功能基因占比最多，分别为324 个（占比8.1%）和283 个（占比7.08%）。在生物过程中，分类到细胞孢子的产生与形成和转录调控、DNA模板化功能基因占比最多，分别为172 个（占比4.3%）和108 个（占比2.7%）。在细胞组分中，分类到膜整体组件和质膜功能基因占比最多，分别为809 个（占比20.73%）和587 个（占比14.68%）。
4.3 KEGG数据库注释
由图6可知，注释结果显示共有2 560 个基因在KEGG途径中富集到细胞过程、新陈代谢、人类疾病、遗传信息处理、有机系统和环境信息处理五大功能中，共计42 条代谢通路。其中注释到新陈代谢的相关基因最多，共计1 780 个，其次依次为环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统，相关基因依次为300、191、150、93 个和46 个。
4.4 CAZyme数据库注释
将菌株SNBS-3中基因组数据与CAZyme数据库进行比对分析，发现基因组中共有147 个基因编码的蛋白质结构域属于CAZyme家族，注释结果如表2所示。由表2可知，糖苷水解酶最多，其次分别为糖基转移酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶、氧化还原酶和碳水化合物结合域。在糖苷水解酶中，纤维素酶基因（GH5家族基因）共有1 个，淀粉酶基因（GH13家族基因）有8 个。
4.5 CARD注释
CARD是目前使用最为广泛、包含最为全面的细菌耐药基因数据库，通过CARD数据库注释，以identity≥80%为条件，CARD注释结果如表3所示。菌株SNBS-3的基因组有耐药基因12 个，其中
ykkC
blt
bmr
ykkD
vmlR基因具有多重耐药性，含有多个耐药受体，推测SNBS-3可能具有一定耐药性。
4.6 VFDB注释
将菌株SNBS-3中基因组数据与VFDB进行比对分析，以identity≥70%作为筛选条件，结果如表4所示。基因组中共发现有4 个毒力因子。其中
clpC毒力基因与细菌黏附相关 ，
clpP毒力基因与菌株生长代谢相关 ，
bslA
capsule两个毒力基因的功能注释未知，还有待研究。
5 抑菌物质预测分析
通过在线软件AntiSMASH和Bagel4挖掘发现SNBS-3产生的抑菌物质信息如表5所示，其细菌素合成基因簇如图7所示。由表5可看出，枯草芽孢杆菌SNBS-3可能产生抑菌物质Subtilosin A、Surfactin、Plipastatin、Mycosubtilosin、Bacilysin、Bacillaene。由图7可知，SNBS-3具有完整合成Subtilosin A基因簇。其中
sboA是编码细菌素Subtilosin A结构基因，翻译后的前体结构没有抑菌活性，需经切割加工为成熟蛋白才有活性 。
albA对Subtilosin A前体翻译后进行修饰，起到结合金属离子和酶辅因子的作用。
albB
albC
albD对菌株起到保护作用，抵御自身分泌的细菌素和环境中的抗菌剂的作用 。
albE
albF
albG负责调控Subtilosin A的合成，与Subtilosin A产量有关 。通过前期抑菌实验和蛋白酶K实验结果可知，上清液抑菌能力下降原因可能是Subtilosin A或其他多肽类抑菌物质被蛋白酶K分解失去活性，而剩下的抑菌活性为不受蛋白酶K影响的其他抑菌物质保留的，因此枯草芽孢杆菌SNBS-3具有合成包括细菌素在内的多种抑菌物质的能力，具有生防菌的潜力。
6 讨论与结论
目前，作为一项高效检测技术，全基因组测序已广泛应用于芽孢杆菌抑菌物质预测与挖掘。本研究通过全基因组测序发现S N B S-3 含有Surfactin、Mycosubtilosin、Plipastatin、Bacilysin、Bacillaene和Subtilosin A等多种抑菌物质的基因簇。这些抑菌物质在芽孢杆菌或其他菌株均有相关报道，其中Surfactin是目前已知的表面活性最强的生物表面活性剂之一，可有效破坏细菌的生物膜；Mycosubtilin是一种由非核糖体合成的Iturin家族脂肽，研究发现枯草芽孢杆菌ATCC6633中产生的Mycosubtilin对引起谷物作物疾病的稻谷镰刀菌和黄萎病镰刀菌具有良好抑制作用。Plipastatin是Fengycin家族脂肽，参与抑制磷脂酶A2和生物膜的形成，可有效抑制常见食源性致病菌。Bacilysin是一种由芽孢杆菌产生的二肽抑菌物质，其可通过抑制葡萄糖胺6-磷酸合酶而发挥对革兰氏阴性食源性致病菌的抑制效果。Bacillaene是一种多烯抗生素，通过抑制蛋白合成发挥作用，本身对光、温度、氧气等因素十分敏感。细菌素Subtilosin A是一种由核糖体合成的抑菌物质，研究发现Subtilosin A对多种细菌具有杀菌活性，在食品保鲜方面具有潜在的应用价值。以上结果表明，通过全基因组测序推测SNBS-3产生的抑菌物质较多，种类广泛，具有良好的生防潜力。
综上，此研究对具有良好抑菌能力的枯草芽孢杆菌SNBS-3进行全基因组测序，通过与多种数据库比对，发现其基因组为一条环状闭合DNA，大小为4 076 387 bp，GC含量为43.82%，预测共有4 000 个蛋白质编码基因、86 个tRNA基因、30 个rRNA基因和91 个sRNA基因。应用AntiSMASH和Bagel4在线分析软件，快速且准确地从基因层面预测枯草芽孢杆菌SNBS-3产抑菌物质及其细菌素Subtilosin A的合成基因簇。解析SNBS-3基因组的同时也有助于未来实现Subtilosin A的异源表达，降低细菌素的生产成本，提高菌株在食品防腐和生物防治方面的应用价值。
作者简介
通信作者：
武俊瑞，教授，沈阳农业大学博士生导师。辽宁省食品发酵技术工程研究中心常务副主任，沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室主任。主要研究方向：乳制品、发酵食品、肠道菌群营养。主持国家自然科学基金面上项目3项，主持其他项目30余项；参加国家863、十二五、十三五、国家星火计划重大项目、国家综改办项目等课题40余项。发表论文150余篇，其中，SCI收录论文56 篇，EI收录论文28 篇。1 篇入选前1% ESI高被引论文，1 篇入选2015—2019年“领跑者5000——中国精品科技期刊顶尖学术论文”。申请国家专利48 件，已授权专利18 件，主编、副主编教材和著作15 部，获得授权的软件著作权11 件。科研成果获中国食品工业协会特等奖1 项、农业部神农中华农业科技奖1 项、全国商业科技进步二等奖2 项、辽宁省自然科学奖1 项、辽宁省科技进步二等奖1 项、山东省科技进步二等奖1 项、齐鲁农业科技二等奖1 项、辽宁省科技进步三等奖1 项等多项奖励。担任 International Journal of Nutrition and Food Sciences客座主编、《中国微生态学杂志》、《乳业科学与技术》、《中国果菜》等杂志编委，国务院学位中心学位论文、教育部博士后基金、国家自然科学基金委、科技部、教育部、辽宁省科技厅、河南省科技厅、沈阳市科技局等评审专家。 Trends in Food Science & Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Food Chemistry、Food Microbiology、International Journal of Food Microbiology、Dairy Science等SCI收录高水平杂志审稿专家。
第一作者：
纪帅奇，沈阳农业大学食品学院2021级直博生，主要从事益生菌资源挖掘，微生物源抗菌肽资源的解析与应用，人工智能数据挖掘等方面的研究，参与国家自然科学基金项目1 项，以第一作者发表学术论文3 篇，其中EI 2 篇，中文核心1 篇，申请国家专利3 项。
文章引用信息
本文《 枯草芽孢杆菌SNBS-3全基因组测序及其 抑菌物质预测分析 》来源于《食品科学》2024年45卷2期57-63 页. 作者：纪帅奇，乌日娜，张淘崴，娄梦雪，丁瑞雪，马颖，武俊瑞*。 D O I: :10.7506/spkx1002-6630-20230409-075. 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为提高我国食品营养与安全科技自主创新和食品科技产业支撑能力，推动食品产业升级，助力‘健康中国’战略，北京食品科学研究院、中国食品杂志社将与湖北省食品科学技术学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物研究所、中南民族大学、湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室、武汉食品化妆品检验所、国家市场监管重点实验室（食用油质量与安全）、环境食品学教育部重点实验室共同举办“第五届食品科学与人类健康国际研讨会”。会议时间：2024年 8月 3—4 日，会议地点：中国 湖北 武汉。
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