《食品科学》：华中农业大学王小红教授等：噬菌体Pu29特性分析及其在沙门氏菌磁分离富集中的应用

沙门氏菌（Salmonella）是一种定植于人类和动物肠道的病原体，是导致人类食物中毒、伤寒、急性胃肠炎和败血症的主要病原体之一。由于沙门氏菌在食品样品中的丰度通常比较低且分布不均匀，因而需要通过对样品中的沙门氏菌进行预富集。磁性纳米颗粒因其具有独特的磁性引起了许多领域的关注与研究，如生物医学、药物输送和诊断学。免疫磁性分离是一种有效的分离技术，它将标记有目标分析物特异性抗体的磁珠与样品进行孵育；在样品管附近的磁铁吸引与分析物结合的磁珠，随后移除剩余的液体。然而，这一方法在捕获效率和成本方面还有待改进。其中，作为识别元件的高亲和力抗体有着昂贵、难以获得、不能区分活细胞和死细胞等缺陷，从而限制了免疫标记磁珠使用范围。因此，有待进一步发掘新型的识别元件，用于食源性病原菌的特异性识别。

噬菌体是能特异性感染宿主细菌的病毒，结构简单，由蛋白质外壳和遗传物质核酸组成。由于噬菌体高度特异性的识别能力以及只能结合活细菌宿主，可将其用作快速细菌筛选中的检测探针。

华中农业大学食品科学技术学院的丁一峰、张宇、王小红*等以筛选得到的1 株鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29（NCBI GenBank登录号为OQ267695）为研究对象，全面分析其生物学及基因组特性，并将其作为特异性识别沙门氏菌的识别元件，利用酰胺反应与羧基化的磁珠偶联形成噬菌体-磁珠探针PhagePu29-MBs，同时优化实验条件，建立一种快速、准确的噬菌体磁分离技术，用于样品中沙门氏菌的快速分离富集，旨在为快速分离富集食品样品中的致病微生物提供新方法与思路。

1 噬菌体Pu29分离纯化及形态观察

如图1A所示，经过5 次纯化后，噬菌体Pu29的噬菌斑形态大小一致，直径约为3.5～4.2 mm，效价可以达到3.4×109 PFU/mL。经过超速离心沉淀噬菌体颗粒后，通过TEM观察噬菌体形态，如图1B所示，噬菌体Pu29有一个二十面体的头部，尾部较长且弯曲，不可收缩。用软件Digital Micrograph Demo 3.9.1测量其大小可知，Pu29头部直径为（68.63±1.68）nm，尾部长度为（179.91±3.50）nm，尾部直径为（9.23±0.21）nm。根据噬菌体的形态学分类标准，Pu29属于长尾噬菌体。

2 噬菌体Pu29宿主谱

如表1所示，噬菌体Pu29可以裂解30 株沙门氏菌（30/36＝83.33%），且出现较清晰透明的噬菌斑，特别是对两株鸡白痢沙门氏菌的裂解效果最佳。噬菌体Pu29还可以裂解5 株大肠杆菌（5/10＝50.00%），对单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌无裂解效果。结果表明噬菌体Pu29是1 株宽谱的烈性噬菌体。

3 噬菌体生物学特性

如图2A所示，当噬菌体Pu29的MOI为0.001时，噬菌体效价最高，达到9.33×10 8 PFU/mL，而当MOI为10时，噬菌体吸附、侵染效果最差，效价为9.00×10 7 PFU/mL。结果表明当噬菌体效价与宿主菌菌量以MOI为0.001侵染时，噬菌体宿主菌内能够增殖更多的子代噬菌体并裂解释放。后续实验均采用最佳MOI培养噬菌体。图2B为噬菌体Pu29对宿主菌C519的吸附速率，噬菌体Pu29的吸附速率在0～15 min呈上升趋势，15 min时达到峰值，最佳吸附速率可达88.67%，表明噬菌体Pu29在15 min能够最大量地吸附在宿主细菌上。在15 min后，吸附速率逐步下降，直到33 min后完成吸附过程。如图2C所示，噬菌体Pu29的潜伏期为30 min，裂解期为180 min，裂解量大约为115.74 PFU/cell。

4 噬菌体稳定性

噬菌体Pu29的原始效价为3.65×109 PFU/mL，其热稳定性结果如图3A所示，噬菌体Pu29温度耐受力较强，在30～50 ℃温度范围内，Pu29与原始效价几乎一致，在60 ℃的环境下孵育1 h之后，其效价下降到3.25×108 PFU/mL。在70～90 ℃之间，随着温度的升高，噬菌体的效价急剧降低。

如图3B所示，当pH值为4～11时，对噬菌体Pu29的活性几乎无影响，并且在此范围内其效价波动较小。而处于pH 3或12的环境下对Pu29进行2 h孵育后，其效价明显降低。当Pu29经过pH值为2或13的条件处理后，其活性完全丧失。

5 噬菌体基因组分析

噬菌体Pu29的基因组长度为45 715 bp，碱基分布情况为A 12 145 个（26.57%）、T 12 506 个（27.36%）、C 10 614 个（23.22%）、G 10 450 个（22.86%），GC平均含量为21 064 个（46.08%）。将噬菌体Pu29全基因组核酸序列提交GenBank，获取的登录号为OQ267695。如图4A所示，使用3 种预测蛋白功能工具（RAST、GeneMarkS和ORF Finder），预测出81 个编码功能蛋白的基因，其中18 个蛋白通过NCBI的在线工具被注释为已知功能，其余为假定功能蛋白。按照功能的不同类型，将其分为4大类：DNA包装与核酸代谢（8 个）、除噬菌体尾部外的结构蛋白（4 个）、有关裂解的蛋白（1 个）、尾部相关的蛋白（3 个）。在功能注释的过程中没有发现有关溶原性的基因，如整合酶等。通过VFDB和ARDB在线数据库对噬菌体Pu29的全基因组序列进行预测，并没有预测出可能的毒力因子以及抗生素抗性基因。

使用BLASTn在NCBI数据库进行比对，筛选出18 株与噬菌体Pu29基因序列相似度高的噬菌体。以这18 株噬菌体和噬菌体Pu29的末端酶大亚基蛋白序列，构建系统发育树，如图4B所示，Pu29的这两个基因都与

Vibrio

Aeromonas

Roufvirus

6PhagePu29-MBs条件优化

如图5A 所示，噬菌体Pu 29 原液的效价为3.4×10 9 PFU/mL，噬菌体Pu29-200 nm磁珠偶联物在4 ℃过夜，PhagePu29-MBs的效价为1.5×10 7 PFU/mL。空白组（MBs）没有出现任何透亮的噬菌斑现象。因此噬菌体Pu29与200 nm粒径的羧基磁珠在4 ℃过夜偶联的效果最佳。

如图5B所示，10 μg PhagePu29-MBs对宿主菌液的捕获效率最低，当增加用量至25 μg时，捕获效率最高，达到76.12%。但继续增加探针的用量时，其捕获效率有所降低，并且保持较稳定的富集效果。因此25 μg探针对宿主细胞的富集作用能够达到最佳效率，后续研究将选取25 μg PhagePu29-MBs富集细菌。

如图5C所示，当孵育5 min时，PhagePu29-MBs对宿主菌液的捕获效率为62.61%，孵育时间从5 min逐渐延长至20 min时，PhagePu29-MBs富集宿主菌液的效率在不断上升，孵育20 min时，捕获效率最高，达到76.09%。但继续延长孵育时间至30 min时，PhagePu29-MBs的捕获效率又有所下降。因此选用20 min的孵育时间对细菌进行富集。

如图5D 所示，在4 ℃环境下孵育20 min 后的PhagePu29-MBs捕获效率较差，仅为53.96%，当环境温度上升时，探针对宿主菌的捕获量也随之增加，在37 ℃恒温条件下其能够达到最佳富集效率，捕获效率达到74.15%。经过以上条件的优化，选择使用25 μg PhagePu29-MBs在37 ℃与宿主菌C519孵育振荡20 min进行富集实验。

7PhagePu29-MBs分离富集沙门氏菌的能力

7.1PhagePu29-MBs分离富集不同浓度的沙门氏菌

如图6A所示，当菌液浓度为4.5×109 CFU/mL时，捕获效率为67.41%，依次加入梯度稀释至4.5×103 CFU/mL菌液的过程中，随着菌液浓度梯度的降低，PhagePu29-MBs捕获效率不断增长，当加入4.5×103 CFU/mL菌液时，其捕获效率最高，可达83.93%。在PhagePu29-MBs中加入4.5×102 CFU/mL的宿主菌液时，捕获效率为57.78%。在加入最低菌量45 CFU/mL的条件下，PhagePu29-MBs仍能捕获25 CFU/mL的宿主细菌，因此噬菌体Pu29与200 nm羧基磁珠偶联物对不同浓度宿主菌C519有良好的前处理分离富集效果。

7.2PhagePu29-MBs的特异性

探究噬菌体Pu29与磁珠偶联之后对不同种属细菌富集的特异性，结果如图6B所示，PhagePu29-MBs对宿主细菌鸡白痢沙门氏菌C519、鼠伤寒沙门氏菌14028、肠炎沙门氏菌13076、猪霍乱沙门氏菌10708、大肠杆菌NCTC 12900和大肠杆菌T10的捕获效率较好，其中对鸡白痢沙门氏菌C519的捕获效率最高，可达75.76%，对猪霍乱沙门氏菌10708的捕获效率较差，为58.20%。另外，相对于沙门氏菌属不同血清型的菌株，对大肠杆菌、单核细胞性李斯特菌及副溶血性弧菌的富集效果较差，其中对单核细胞性李斯特菌19114的捕获效率最低，为24.04%。证明噬菌体Pu29与磁珠的结合物能对不同血清型的沙门氏菌以及大肠杆菌进行富集且捕获效率较理想。而对其他菌株的捕获效率均小于36%，说明PhagePu29-MBs具有良好的特异性。

7.3PhagePu29-MBs捕获沙门氏菌的TEM

通过TEM对200 nm（10 mg/mL）羧基磁珠进行观察，结果如图7A所示，在2 μm视野下观察到大量微球颗粒聚集。PhagePu29-MBs分离富集宿主菌C519，对复合物进行TEM观察，结果如图7B所示，视野中观察到PhagePu29-MBs捕获沙门氏菌（红色箭头）。因此，PhagePu29-MBs能够对沙门氏菌进行分离富集。

8PhagePu29-MBs对样品中沙门氏菌的分离富集

如图8所示，PhagePu29-MBs对脱脂牛奶的整体富集效果最佳，当在5%脱脂牛奶中加入3.77×103 CFU/mL菌液时，捕获效率达到最大值，为92.92%。在LB中富集宿主菌的效率较低，当对3.77×103 CFU/mL的菌液进行富集后，捕获效率为75.90%，对3.77×106 CFU/mL菌液的捕获效率相比之下有所下降，为63.98%。然而在全脂奶粉配制成的5%及15%牛奶中，PhagePu29-MBs对宿主菌C519的富集效率明显降低，在15%全脂牛奶中加入3.77×106 CFU/mL的菌液后，经过37 ℃振荡20 min的富集，PhagePu29-MBs的捕获效率最低，仅达到51.69%。

沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的第二大食源性疾病，对公众健康构成巨大威胁，并给许多国家造成经济负担，尤其是食品行业。沙门氏菌可以在各种食物中检测到，如鸡蛋、蛋制品、肉类、奶酪、新鲜水果和蔬菜。因此，在整个食品供应链中快速准确地监测和检测沙门氏菌对于早期预防食源性疾病爆发至关重要。在食品样品中沙门氏菌通常规定为不得检出，但是沙门氏菌在实际样品中的丰度通常比较低且分布不均匀，这对于检测技术提出了更高的要求。噬菌体作为一种新型的识别元件，在食源性病原菌的预富集以及检测方面有着广阔的应用前景。

噬菌体作为是一类专门吸附细菌的生物，具有特异性识别宿主细菌的特点。利用这一特点已经开发了一些方法用于细菌的特异性检测，这些方法主要是基于噬菌体尾部中的受体结合蛋白（尾纤蛋白或尾刺蛋白），或者由相关裂解酶的识别区等介导。噬菌体的宿主范围可以很宽也可以很窄，因此有可能识别出整个属或物种。此外，在温度、pH值和离子强度等因素方面，噬菌体比抗体表现出更大的稳定性。噬菌体的低成本、大容量制备和高靶向特异性特点使其有望在病原体控制和检测中应用开发。本研究采用的沙门氏菌噬菌体Pu29能够在15 min就能实现对沙门氏菌的最大吸附，为88.67%。将其与羧基化的纳米磁珠偶联，得到PhagePu29-MBs，其捕获效率最高为83.93%，最低捕获菌量为45 CFU/mL，该方法分离富集沙门氏菌的时间大约为30 min，展现出其特异性捕获沙门氏菌的特点。噬菌体Pu29的潜伏期为30 min，而PhagePu29-MBs在20 min内即可完成对样品中沙门氏菌的分离富集，能够较大程度分离富集沙门氏菌。但长时间的孵育，噬菌体的裂解活性会导致细菌裂解。在后续的研究中，可利用噬菌体受体结合蛋白作为检测食源性病原菌的识别元件，避免操作过程中时间过长噬菌体导致细菌发生裂解作用。

在加入一定菌量宿主菌的5%和15%脱脂牛奶中，PhagePu29-MBs能够高效地富集到大量宿主菌C519，捕获效率达到92.92%左右。而因为全脂牛奶有更多的脂肪和脂溶性维生素等物质，比脱脂牛奶的成分更加复杂，故在5%和15%的全脂牛奶中，PhagePu29-MBs对宿主菌的捕获效率大大降低，为53.86%左右。黄震等将抗体与磁珠偶联制备免疫磁分离探针，构建的免疫磁性分离方法能够在35 min内完成牛奶中大肠杆菌O157:H7的高效富集，捕获效率在50%～93%之间。Zhou Yan等将噬菌体P100与磁性微粒偶联制备生物探针，该探针在20 min内即可实现单核细胞性李斯特菌的分离富集，捕获效率为40%左右。因此，本研究基于噬菌体Pu29建立的快速分离富集沙门氏菌方法具有潜在的应用价值。

结 论

本研究分离纯化得到1 株轮状病毒属（

Roufvirus

本文《 噬菌体 Pu29 特性分析及其在沙门氏菌 磁分离富集中的应用 》来源于 《食品科学》2023年45卷第 2 期 163 - 171 页，作者： 丁一峰，张 宇，刘 茜，黄晨曦，邵彦春，王小红 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20230504-017 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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