药学1区: 湖南中医大揭示赤芍-附子药对通过调节巨噬细胞极化改善慢加急性肝衰竭的作用机制

【写在前面】：巨噬细胞作为免疫调节的关键角色，一直是国家自然科学基金研究的热点领域。在中医药学界，这一主题同样备受瞩目。本期推荐的是由湖南中医药大学等研究团队近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示赤芍-附子如何通过调节巨噬细胞极化来改善慢加急性肝衰竭（ALCF）的研究文章。这项研究不仅展示了中医药在现代医学中的潜力，也为肝衰竭的临床治疗提供了新的视角和策略。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Chishao-Fuzi herbal pair restore the macrophage M1/M2 balance in acute-on-chronic liver failure

在这项研究中，我们首先从HBV-ACLF患者、免疫活跃期的慢性乙型肝炎（CHB）患者和健康个体中获取外周血样本。使用流式细胞术、实时定量PCR（qRT-qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）来揭示HBV-ACLF患者外周血中单核细胞-巨噬细胞的活化状态及相关细胞因子的表达差异。随后，建立ACLF大鼠模型和体外巨噬细胞炎症模型。使用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、透射电子显微镜、流式细胞术、western blot、RT-qPCR和ELISA来观察赤芍-茯苓草药对干预后体内外M1/M2巨噬细胞标志物及相关炎症因子表达的变化。

研究表明，HBV-ACLF患者表现出M1/M2巨噬细胞极化的不平衡，倾向于激活M1巨噬细胞，CD86和iNOS表达高。这种不平衡导致相关促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）增加，抗炎因子（IL-10、TGF-β、VEGF）减少，加剧了不受控制的免疫炎症反应。赤芍-附子干预改善了ACLF大鼠的肝功能、凝血功能和组织病理损伤。它还部分改善了ACLF的内毒素血症和炎症损伤。进一步研究发现，赤芍-附子可能是通过促进巨噬细胞向M2抗炎方向极化，抑制M1巨噬细胞的活化，增加抗炎因子水平，减少促炎因子，恢复免疫炎症失衡，防止炎症反应加剧至肝衰竭。

图文摘要

【前言】

慢性肝病是一个日益增长的全球健康问题，常常从肝纤维化进展到肝硬化、失代偿和最终的危重疾病，成为受影响人群中死亡的主要原因。这种进展的一种严重表现是急性-慢性肝衰竭（ACLF），这是一种以肝功能迅速恶化为特征的临床综合征。ACLF表现为黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病和腹水等特征性症状。这种情况构成了重大威胁，因为它被认为是慢性肝病患者中常见的危重紧急情况，预后差且死亡率高。在中国，导致肝衰竭的主要原因归因于乙型肝炎病毒（HBV）及其相关状况，乙型肝炎病毒相关的急性-慢性肝衰竭（HBV-ACLF），约占ACLF病例的80%。因此，我们目前的研究努力集中在有效降低HBV-ACLF患者的死亡率并改善其预后。

HBV-ACLF的发病机制复杂，涉及病毒、凋亡、免疫和炎症等其他病理机制的复杂相互作用。急性损伤或病原体直接或间接激活肝脏内不同类型的细胞和炎症细胞因子途径。这种激活导致持续性炎症，这是肝组织损伤的标志。持续性的炎症反应似乎是由免疫系统介导的，是肝衰竭发展的关键因素。具体来说，先天免疫介导的肝损伤是肝衰竭的主要机制。巨噬细胞是先天免疫中最重要的细胞之一，表现出显著的异质性和功能多样性。它们在身体防御、组织修复、维持稳态和对炎症疾病的反应中发挥着至关重要的作用。

值得注意的是，巨噬细胞可以根据不同的刺激分化，导致它们的表型和形态发生变化——这一过程被称为巨噬细胞极化。这一独特的功能使巨噬细胞成为与各种急性和慢性肝病相关的复杂损伤和修复机制中的关键参与者。巨噬细胞可以根据对环境刺激的反应极化为两种主要的激活状态：经典激活的巨噬细胞（M1型）和替代激活的巨噬细胞（M2型）。这种极化模式，被称为M1/M2，与辅助T细胞1（Th1）/辅助T细胞2（Th2）反应模式相似，并作为肝衰竭炎症级联反应的关键组成部分，影响疾病进展和预后。

在传统中医（TCM）的背景下，ACLF通常被称为“黄疸”，“疫黄”和“肝衰竭”，由于其明显的黄染症状。基于阴阳原理的中医辨证论治已达成共识。阳黄传统上通过清除热邪和促进利尿的方法治疗（称为“清热法”），而阴黄则通过温阳和健脾的方法治疗（称为“温阳法”）。重要的是，我们的研究团队在中医框架内引入了“阴阳黄”的创新概念。这一概念导致了一种名为“阳黄-阴阳黄-阴黄”的辨证论治模型的发展，用于ACLF和中医治疗方法的“清热与温阳结合”，取得了显著的治疗效果。“温阳解毒化瘀方”是“清热与温阳结合”的代表方剂，强调温阳法的全过程干预，并已纳入临床指南。

赤芍（芍药根）和附子（乌头侧根）是“温阳解毒化瘀方”的两种核心药物，分别代表“清热法”和“温阳法”。这些对在ACLF的临床治疗中被证明具有很高的代表性。先前的研究表明，高剂量赤芍与附子的联合使用有效地消除黄疸，降低肝酶，缓解炎症反应，并调节免疫活性，从而为对抗肝衰竭提供了一种有希望的方法。药效学评估进一步证明50克赤芍和15克附子具有最佳治疗效果。然而，这种免疫-炎症调节机制是否与巨噬细胞极化相关需要进一步研究。因此，本研究旨在探索赤芍-附子草药对在减轻由巨噬细胞极化引起的肝衰竭中的协同机制。

【结果部分】

1. HBV-ACLF患者单核细胞-巨噬细胞的表型特征。

2.赤芍-附子草药对药效物质基础分析。

3.赤芍-附子草药对体内ACLF肝损伤的抑制作用。

4.赤芍-附子草药对调节巨噬细胞极化。

5.赤芍-附子草药对通过调节巨噬细胞极化减轻ACLF中的炎症反应。

6.赤芍-附子草药对RAW264.7细胞结构的保护作用。

7.赤芍-附子草药对体外LPS诱导的RAW264.7细胞M1/M2极化的影响。

【结论与讨论】

在这项研究中，我们从巨噬细胞极化的角度探讨了HBV-ACLF患者的免疫炎症状态。此外，我们还检查了赤芍-附子草药对肝衰竭及其调节巨噬细胞极化的影响。我们的研究揭示了HBV-ACLF患者巨噬细胞表型和功能的改变。赤芍-附子草药对通过促进M2巨噬细胞极化并恢复M1和M2表型之间的免疫平衡，有效减轻了ACLF的炎症反应负担。这些发现支持巨噬细胞极化作为HBV-ACLF潜在的“免疫检查点”的概念，为未来研究其机制奠定了基础。此外，探索赤芍-附子草药对的抗肝衰竭效果并实现对巨噬细胞功能的有选择性调节将是有趣的。

全身性炎症是ACLF器官衰竭和死亡的主要原因；然而，免疫功能障碍在ACLF的发病机制和结果中起着关键作用。肝巨噬细胞，包括驻留巨噬细胞（库普弗细胞）和单核细胞衍生的巨噬细胞（单核细胞-巨噬细胞），是肝脏中最丰富的免疫细胞。它们在维持肝脏稳定、调节免疫系统、识别和消除病原体以及清除细胞碎片方面发挥着重要作用。不幸的是，只有少数研究报告了ACLF中巨噬细胞的异质性。然而，根据我们的结果，它可能与ACLF的高炎症状态有关。

我们的研究显示，与健康个体相比，CHB和HBV-ACLF患者单核细胞-巨噬细胞的数量增加。然而，随着肝损伤的加重，巨噬细胞的异质性发生了变化，表明倾向于激活表达CD86和iNOS的M1型巨噬细胞。同时，与健康个体和CHB患者相比，HBV-ACLF患者显示出抗炎因子水平升高。HBV-ACLF中的功能障碍被认为是与“不受控制的炎症反应”状态密切相关的。有趣的是，我们进一步分析了HBV-ACLF患者单核细胞-巨噬细胞上的表型标记与HBV DNA之间的相关性。结果表明，CD86表达与HBV-DNA水平呈正相关，表明M1型巨噬细胞表型的激活与HBV病毒活动有关。

有研究发现，HBV感染后肝巨噬细胞被激活，其激活标记CD163和甘露糖受体（MR）与CHB患者肝活检中的炎症活动和纤维化有关。抗病毒治疗可以降低表达水平。然而，其他研究表明，CHB患者中HBcAg刺激导致M2型巨噬细胞极化受损，这介导了促炎细胞因子的增加分泌。HBcAg对巨噬细胞和炎症介质的影响可以通过增加M2型巨噬细胞上的TLR2表达来消除。我们的研究表明，HBV-ACLF患者表现出更明显的M1型巨噬细胞激活，导致炎症失衡增加。这可能不仅与HBV病毒介导的因素有关，还与肝衰竭患者肠道通透性增加、大量趋化因子和炎症介质从受损或凋亡的肝细胞释放，以及肠道微生态的改变有关。这些因素导致肝脏内毒素和细菌易位水平升高，激活识别受体并触发炎症级联反应，加剧肝损伤。因此，调节巨噬细胞极化对于缓解ACLF的高炎症状态尤为重要。

赤芍和附子是具有悠久使用历史的常用临床草药。赤芍最早记载于著名的传统中医经典《神农本草经》，属于肝经，主要用于清热、凉血、散瘀和止痛。附子在恢复阳气、挽救患者于危重、驱散寒邪和缓解疼痛方面有效。它们被广泛用于治疗肝病，并在临床实践中显示出抗肝衰竭的效果。它们的使用与ACLF的中医综合征特征一致，表现为虚实夹杂。为了进一步研究赤芍-附子草药对在ACLF治疗中的作用机制，我们建立了体内ACLF大鼠模型和体外巨噬细胞炎症模型。从体内实验中，我们观察到赤芍-附子草药对改善了ACLF大鼠的肝功能、凝血功能和肝脏组织病理损伤。它还部分改善了ACLF的内毒素血症和炎症损伤。我们分析了ACLF大鼠肝组织的巨噬细胞表达谱，并确认了巨噬细胞极化失衡的存在，表现为M1型极化的促炎症状态。 这一发现与从HBV-ACLF患者外周血单核细胞-巨噬细胞表型特征研究中得出的结论一致。 这些结果可以通过使用对数运动和赤芍-附子草药对进行干预来逆转。 令人惊讶的是，我们发现赤芍-附子草药对下调CD86和iNOS表达的程度小于乳果糖口服液，而上调CD206和Arg1表达的程度大于乳果糖口服液。 因此，我们推测乳果糖口服液的抗炎作用可能与促进肠道氢气（H2）的产生有关，这通过氧化还原反应抑制炎症因子和内源性内毒素进入血液，从而抑制M1型巨噬细胞的诱导激活。 另一方面，赤芍-附子草药对倾向于通过调节免疫稳态间接增强机体的抗炎效果，从而抑制过度的炎症反应。 我们还使用体外方法可视化了赤芍-附子草药对对巨噬细胞结构、表型和功能的影响，证实了其对抗ACLF的效果以及调节巨噬细胞极化的能力。

我们的研究也有一些需要改进和进一步深入探索的领域。首先，由于某些限制，通过外周血收集分析HBV-ACLF患者单核细胞-巨噬细胞的免疫炎症状态可能无法直接反映患者肝脏的实际状况。如果条件允许，我们将收集肝组织以确定巨噬细胞的表型和功能状态，并努力获得更大的样本量以增加数据分析结果的可靠性。此外，我们还将深入研究识别赤芍-附子草药对中对其抗肝衰竭效果有贡献的具体药效成分上。

总之， 我们的研究表明，巨噬细胞作为ACLF炎症级联反应的一部分，在ACLF的发病机制中发挥着关键作用。赤芍-附子草药对可以通过促进巨噬细胞向M2抗炎方向极化，抑制M1型巨噬细胞的激活，有效防止肝衰竭中炎症反应的进一步加剧，从而恢复免疫失衡。这一免疫调节机制为研究HBV-ACLF的免疫重建和炎症反应提供了新的视角和思路，这对于促进中医药在肝衰竭治疗中的应用，并深入研究赤芍-附子草药对中发挥抗肝衰竭效果的具体药效成分具有重要意义。

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