复方结合代谢组发1区: 江西中医大揭示柴胡皂苷改善皮层鞘脂代谢引起神经血管耦合发挥抗抑郁作用

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导读

由于抑郁症的发病机制复杂，抗抑郁治疗仍达不到预期。最近的证据表明抑郁症与脂质代谢之间存在联系。柴胡皂苷（SS）在现代药理学中具有抗抑郁和调脂作用。然而，目前尚不清楚脂质调节是否是SS抗抑郁作用的关键作用机制。本研究分析了SS的抗抑郁活性与脂质代谢调节之间的关系，并探讨了潜在的机制，采用APOE-/-小鼠，结合慢性不可预知轻度应激（CUMS）模型，通过行为学、电生理学和非靶向脂质组学研究SS抗抑郁活性与脂质代谢的关系；采用蛋白质印迹、原代细胞培养技术和激光斑点脑血流成像来阐明潜在的机制。APOE-/-小鼠在CUMS中表现出更严重的抑郁样行为和鞘脂代谢失调。SS可减轻CUMS引起的抑郁行为和皮层鞘脂代谢紊乱，但对APOE-/-小鼠无影响。SS通过酸性鞘磷脂酶（AMSase）缓解神经酰胺（Cer）和鞘磷脂（SM）之间的不平衡。此外，SS通过鞘脂代谢调节神经元谷氨酸释放，减轻CUMS诱导的神经血管偶联抑制（调节代谢型谷氨酸受体和IP3受体），从而改善抑郁小鼠脑血流量的减少。本研究强调了脂质代谢在SS抗抑郁活性中的作用，并探讨了其潜在机制。这项研究为更好地理解植物药物的抗抑郁机制提供了新的见解，同时增加了脂质代谢作为抑郁症治疗策略的可能性。

论文ID

原名：Saikosaponin antidepressant mechanism: Improving the sphingolipid metabolism in the cortex via Apolipoprotein E and triggering neurovascular coupling

译名：柴胡皂苷抗抑郁机制：通过载脂蛋白E改善皮层鞘脂代谢并触发神经血管耦合

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.06

通讯作者：苏丹

通讯作者单位：江西中医药大学

实验设计

实验结果

1. CUMS在APOE-/-小鼠中表现出更严重的抑郁行为

为了确定APOE与CUMS诱导的抑郁行为有关，我们检测了WT-CUMS小鼠大脑中的APOE水平。如图1AI-AII所示，CUMS显著降低了APOE蛋白的表达。为了进一步验证APOE在CUMS中的作用，我们将APOE-/-小鼠用于CUMS建模和随后的行为测试（图1B）。在CUMS之前，WT组和KO组之间的基线蔗糖偏好指数没有显示出显著差异（图1CI）。CUMS后，WT-CUMS和KO-CUMS组均表现出显著的抑郁样行为（图1C-F）。我们进一步发现APOE-/-小鼠表现出更严重的抑郁行为。结果显示，与WT-CUMS组相比，KO–CUMS组在SPT中表现出糖-水偏好的显著降低（图1CII），在强迫游泳测试(FST)中表现出不动时间的增加（图1F），在旷场实验（OFT）中表现为总距离的减少（图1DI）和中心的总距离减小（图1DII）（图1DIII显示了轨迹图），在高架十字迷宫实验（EPM）中表现为开放臂进入的减少（图图1EII）和开放臂时间的缩短（图1EI）。

图1 CUMS在APOE-/-小鼠中表现出更严重的抑郁行为。（A I-II）各组APOE的表达水平（Mean±SEM，n≥3）。（B）实验过程示意图。（C I）蔗糖偏好基线。（C II）蔗糖偏好试验(SPT)。（D）OFT。（D I）总移动距离。（D II）中心区域的移动距离。（D III）运动热图。（E） EPM。（E I）进入开放臂次数。（E II）进入开放臂时间。（F）FST中的不动时间。注：数据代表平均值±SEM，n=10。*p<0.05和**p<0.01。通过学生t检验（A II，C I）和双因素方差分析（C II，D-F）进行比较。

皮层神经网络负责与各种复杂情绪行为相关的信号处理。神经震荡活动是神经网络功能的重要标志。研究表明，gamma（30–100 HZ）频带的异常振荡与抑郁症患者的情绪和认知功能受损密切相关。我们通过多通道电生理系统记录了小鼠大脑皮层的局部场电位（LFP）（图2A），并使用Neuroexplorer软件分离了LFP的gamma带（图2BI-BII）。结果显示，与WT-CUMS组相比，KO–CUMS组的gamma带频率显著增加（图2E）。图2C显示了锥体神经元的特征（图2CIII），包括放电间隔直方图中的一个短而尖锐的单峰（图2CI）和自相关图中显示的递减峰（图2CII）。锥体神经元是皮层神经网络中主要的兴奋性神经元，其异常活动和神经元兴奋性损伤会促进抑郁症的发展。结果显示，暴露于CUMS后，KO小鼠中锥体神经元的放电频率显著低于WT小鼠（图2F）。

基于行为学和电生理学的结果表明APOE-/-小鼠在CUMS中表现出更严重的抑郁行为。

图2 电生理学。（A）LFP的时频分析示意图。模型组小鼠的能谱比对照组红得少，整体能量低，说明其放电异常。（B）gamma振荡（30–100赫兹）。（B I）神经元放电的原始图谱。（B II）相对功率谱密度分析。（C）锥体神经元。（CI）放电间隔直方图（ISI）。（CII）自相关图。（CIII）神经元波形。（D） 锥体神经元的自发放电频率。（E）各组小鼠gamma节律振荡的统计结果。（F）各组小鼠峰值的统计结果。注：数据代表平均值±SEM，n≥3。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。通过双因素方差分析进行比较。

2. APOE缺乏加剧CUMS诱导的脂质代谢异常

鉴于APOE在脂质代谢中的重要作用，我们使用非靶向脂质组学研究APOE缺乏对抑郁行为的影响是否与脂质代谢的改变有关。结果表明，各组的脂质代谢谱表现出相似性，但峰值强度存在差异（补充图1）。如图3A中的得分图所示，对照组和CUMS组之间的分离表明CUMS导致脂质代谢的改变。值得注意的是，对照组彼此非常接近，而WT-CUMS和KO-CUMS组彼此明显远离（图3A）。我们根据VIP≥1.5筛选和鉴定差异脂质代谢产物（补充表2）。富集途径分析显示，CUMS对12种脂质代谢途径有影响（图3C），尤其是鞘脂代谢（图3B）。

然后，我们进一步分析了脑鞘脂代谢产物的变化，包括鞘磷脂（SM）、神经酰胺（Cer）、鞘氨醇、GlcCeramide（GlcCer）和半乳糖酰基鞘氨醇。如图3D所示，与对照组相比，CUMS组的SM水平降低，而Cer、鞘氨醇、GlcCr和半乳糖酰基鞘氨醇的水平增加。图3B显示了这些鞘脂的代谢途径。此外，与WT-CUMS组相比，KO–CUMS组显示SM水平降低（图3DI-DII），Cer水平升高（图3DV-DVI）、鞘氨醇（图3DVII）、GlcCr（图3DIII）和半乳糖酰基鞘氨醇（图3DIV），这表明APOE缺乏会加剧CUMS诱导的鞘脂代谢异常。

图3 脑脂质的代谢组学研究。（A）SIMCA-P 13.0对正离子和负离子模型中各组脑脂代谢的PLS-DA评分。（B）鞘脂代谢途径。（C）使用MetaboAnalyst进行代谢物途径富集分析(http://www.metaboanalyst.ca).（D）各组鞘脂代谢产物的变化。注：数据代表平均值±SEM，n=6。*p<0.05和**p<0.01。通过单因素方差分析进行比较。

3. SS改善CUMS诱导的抑郁样行为并上调APOE表达

图4A显示了实验流程的示意图。行为结果显示，与CUMS组相比，SS组在SPT中的蔗糖摄入量增加（图4B），这表明快感缺乏减轻；OFT中SS组的总移动距离（图4DI）和中心进入次数（图4DII）显著增加；在FST中SS组的静止时间减少（图4C），表明行为绝望得到改善。脑血流量结果显示，SS显著缓解了CUMS引起的脑血流量下降（图4EI-EII）。图4DII和4EII显示了OFT的轨迹图和脑血流的示意图。这些结果表明SS可以改善CUMS引起的抑郁行为。在评估了不同剂量的抗抑郁作用后，我们选择SS的浓度（100mg/kg/d）来进一步研究其作用机制。

图4 SS可改善CUMS暴露引起的抑郁样行为。（A）实验过程示意图。（B）蔗糖偏好测试。（C） FST中的不动时间。（D）OFT。（D I）总移动距离。（D II）进入中心的次数。（D III）运动轨迹图。（E I-II）激光散斑脑血流成像。注：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示与CUMS组相比存在显著差异（平均值±SEM，n=10）。通过单因素方差分析进行比较。

WB结果显示，SS组可以显著上调APOE的表达（图5AI-AII）。为了研究APOE对SS抗抑郁作用的影响，我们使用了APOE-/-小鼠（图5B）。结果显示，对APOE-/-小鼠给予SS不会产生抗抑郁样作用，包括SS组与CUMS组在SPT中糖偏好（图5C），在OFT中进入中心的时间（图5DI）和总运动距离（图5DII）（图5DIII显示了轨迹图）以及FST中静止时间没有显著差异（图5E）。此外，脑血流量分析结果显示，SS不能逆转CUMS诱导的APOE-/-小鼠脑血流量下降（图5FI-FII）。

图5 （A I-II）各组APOE的表达水平（Mean±SEM，n≥3）。（B）实验过程示意图。（C）蔗糖偏好测试。（D）OFT。（D I）总移动距离。（D II）进入中心的次数。（D III）运动轨迹图。（E）FST中的不动时间。（F I-II）激光散斑脑血流成像。注：数据代表平均值±扫描电镜，n=10*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。通过单因素方差分析进行比较。

4. SS治疗改善CUMS引起的鞘脂代谢紊乱

我们使用非靶向脂质组学来探索SS对CUMS诱导的抑郁小鼠皮层脂质代谢的影响（补充图2）。多变量统计分析显示，在正离子和负离子模式下，对照组和CUMS组之间存在显著的代谢差异（图6A-B），证明了CUMS模型的成功复现。PLS-DA模型置换检验结果证明了该模型的可靠性和准确的预测能力，不会出现过拟合（补充图3）。对各组代谢谱的进一步分析显示，SS给药组和对照组的代谢谱基本重叠，而APOE组偏离对照组，接近CUMS组（图6C-D）。这表明SS显著调节抑郁小鼠的中枢脂质代谢紊乱，但对缺乏APOE的KO抑郁小鼠没有影响。

图6 正离子和负离子作用下小鼠皮层脂质代谢产物的多变量统计分析。（A-B）正、负离子模式下对照组和CUMS组PLS-DA评分图（正：R2Y=0.995，Q2=0.959；负：R2Y=0.994，Q2=0.962）。（C-D）正离子和负离子模式下各组的PLS-DA评分图。

基于S图中VIP≥1.2（补充图4）和P值（P≤0.05），我们对差异代谢物进行了筛选（补充表3），并通过火山图将其可视化（图7A）。然后对不同脂质的类别和亚类计数进行统计和图形分析（图7B-C）。同时，我们分析了这些不同脂质的KEGG途径，表明CUMS小鼠的脑脂质代谢紊乱与鞘脂代谢有关（图7D），与图3中的结果一致。随后，我们评估了各组的鞘脂差异代谢产物。图7E显示了各组之间鞘脂代谢产物的变化，CUMS组的神经酰胺（Cer）和己基神经酰胺（HexCer）代谢产物显著增加，SS给药组的代谢产物显著下降。此外，鞘磷脂（SM）代谢产物在CUMS组中显著减少，在SS给药组中增加。我们检测了各组小鼠皮层中酸性鞘磷脂酶（ASMase）蛋白的表达水平，ASMase是鞘脂代谢中的一种关键酶，可将SM水解为Cer。结果显示，CUMS组ASMase表达增加，SS给药后ASMase表达显著下降（图8A）。

图7 （A）与脂质类别相关的火山图。点的类型和颜色对应于脂质亚类。（B）脂质分子的子类统计环图。（C）LIPID MAPS分类及统计圆图。（D）上方路径的匹配气泡图。（E）各组鞘脂代谢产物的变化。注：*p<0.05和**p<0.01表示与CUMS组相比存在显著差异（平均值±SEM，n=6）。通过单因素方差分析进行比较。

5. SS通过调节NVC增加CUMS诱导的脑血流量减少

鞘脂的改变可能会影响谷氨酸等神经递质的释放。因此，我们分析了每组小鼠皮层中谷氨酸的释放情况。结果显示，模型组小鼠大脑皮层谷氨酸水平显著降低；同时，SS给药显著增加（图8A）。我们通过培养原代皮层神经元（补充图5）来研究谷氨酸释放和神经元脂质之间的相关性。在与含有SM的培养基孵育两小时后，与对照组相比，SM组的神经元出现谷氨酸释放的增加（图第8B段）。

研究表明，神经元释放的谷氨酸可以影响星形胶质细胞的mGluR并激活IP3R，从而提高细胞末端足部的Ca2+浓度，这与脑血流量有关。因此，我们分析了mGluR和IP3R蛋白在每组小鼠中的表达。结果显示，CUMS降低了mGluR的表达（图8D）和IP3R（图8E），而SS给药有效地恢复了它们的水平。

图8 （A）各组小鼠皮层谷氨酸含量。（B）与对照组相比，SM组谷氨酸的释放。（C）酸性鞘磷脂酶蛋白在各组小鼠中的表达。（D）mGluR蛋白表达水平。（E）IP3R蛋白表达水平。注：*p<0.05和**p<0.01表示与CUMS组相比存在显著差异（平均值±SEM，n=6）。通过单因素方差分析进行比较。

这项研究表明，APOE缺乏会加剧CUMS诱导的抑郁样行为和脂质代谢紊乱。在此基础上，我们发现APOE介导的中枢鞘脂代谢在SS的抗抑郁活性中起着至关重要的作用。图9显示，SS通过APOE改善大脑皮层的鞘脂代谢并触发神经血管耦合来发挥抗抑郁作用。

在抑郁表型的研究中，与WT小鼠相比，KO小鼠表现出更严重的抑郁样症状。这与临床研究一致，临床研究表明，携带APOEε4等位基因的个体在老年时更容易患抑郁症，这可能表现为认知和情绪障碍。此外，在APOE相关研究中，需要避免与年龄相关的假阳性。例如，六个月大且衰老的APOE-/-小鼠自然表现出类似焦虑的抑郁症状和行为。为了消除假阳性结果，我们的研究采用了以下方案：（1）选择7周大的小鼠，以避免KO小鼠因年龄而出现抑郁症状；（2）在CUMS之前进行糖偏好测试，以确保所有小鼠都处于相似的状态。

随后的脂质组学分析表明，抑郁症会导致皮层脂质代谢紊乱，尤其是鞘脂代谢紊乱。多项临床研究表明，鞘脂代谢失调是抑郁症患者代谢功能障碍的一个重要特征，这与我们的研究结果一致。值得注意的是，在CUMS下，KO小鼠表现出更严重的脂质代谢紊乱，这表明APOE介导的鞘脂代谢参与了抑郁症的发病机制。CUMS可引起脑脂质代谢产物的变化并破坏脂质代谢。APOE蛋白参与中枢神经系统中脂质的运输和再分配，并可通过运输脂肪酸、鞘脂和胆固醇等脂质来帮助调节脂质变化，以维持脂质稳态。这可以部分缓解CUMS引起的中枢性脂质紊乱。当受到外部因素的持续刺激时，各种脂质代谢产物的水平持续变化，APOE的疗效下降，并出现中枢神经系统功能障碍，导致认知、情绪等异常，表现出抑郁症状。

SS是北柴胡和红柴胡中最重要的活性成分之一，在东方国家经常使用。据报道，它不仅具有抗抑郁作用，而且同样具有极好的调脂作用。因此，SS对抑郁行为的改善可能与中枢脂质代谢的调节有关。本研究采用APOE-/-小鼠联合CUMS模型，通过行为学实验和脂质组学研究SS抗抑郁活性与脂质代谢调节的关系。行为学结果显示，SS显著改善了CUMS诱导的抑郁样行为。脂质组学结果显示，SS给药后，WT-SS组与空白组基本重叠。然而，KO-SS组转移到了另一边，这表明SS的抗抑郁作用与APOE介导的脂质代谢有关。由于APOE蛋白参与神经元脂质供应，当APOE减少或功能失调时，可能会导致神经元脂质供应的变化，影响整体脂质代谢，并导致SS抗抑郁活性的丧失。SS对CUMS诱导的脂质代谢紊乱的调节主要是鞘脂代谢，其中以甘油磷脂代谢尤其是鞘脂的代谢最为显著。鞘磷脂（SM）和神经酰胺（Cer）是中枢神经系统中典型的鞘脂类型。其中，SM是质膜的基本元素，其水平对细胞功能至关重要，而Cer除了构成细胞膜的结构外，还广泛参与细胞生长和分化等生理过程。SM和Cer以一种稳态关系存在，这种关系在很大程度上受酸性鞘磷脂酶（ASMase）的调节。在CUMS下，这种平衡被破坏；因此，鞘脂代谢受到干扰。SS减轻了抑郁小鼠皮层中Asmase的上调，从而调节SM和Cer水平，并促进皮层鞘脂代谢稳态的恢复。

谷氨酸神经元作为皮层的主要兴奋性神经元，其释放神经递质的过程受到突触膜鞘脂的调节。释放的谷氨酸能神经递质可以通过代谢型谷氨酸能受体（mGluR）调节星形胶质细胞。具体而言，星形胶质细胞在接受谷氨酸后激活PLC信号，从而引起内质网IP3R的激活，导致Ca2+离子浓度增加。一旦Ca2+信号被传递到星形胶质细胞的末端足，它就会对血管系统产生局部作用，以调节脑血流量。这是一种连接神经元和血管的通讯机制，称为NVC，是中枢血管调节的主要模式之一。我们的研究表明，CUMS后，皮层脂质代谢发生改变，导致谷氨酸能神经元的突触活性发生变化，并抑制NVC机制，最终导致脑血流量减少，SS可以缓解这种情况。

图9 SS通过APOE改善皮层鞘脂代谢并触发神经血管耦合来治疗抑郁症的分子机制。

结论

总之，SS的抗抑郁作用与其降脂作用是分不开的，其机制包括通过APOE调节皮层鞘脂代谢，并通过NVC机制缓解抑郁小鼠脑血流量的减少，从而改善抑郁症状。这些发现为SS作为一种临床抗抑郁药的开发和应用提供了基础。此外，我们的研究还增加了靶向脂质代谢作为抑郁症治疗方法的可能性，并丰富了降脂抗抑郁药的开发和研究的治疗策略。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324004872

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