华盛顿大学开发，表达长片段肌营养不良蛋白

杜氏肌营养不良症 (DMD) 是由肌营养不良蛋白基因突变引起的，会导致患者体内几乎完全缺乏肌营养不良蛋白。肌营养不良蛋白的缺失导致肌肉坏死，逐渐的肌肉萎缩，炎症性浸润以及最终的心脏和呼吸衰竭。

肌营养不良蛋白基因是迄今发现的最大的人类基因，具有 79 个外显子，大约 230 万个碱基对，表达的肌营养不良蛋白分子量大约 427KDa。它在保护细胞免受机械压力方面发挥着关键作用，并通过为多种蛋白质提供支架，调节多种细胞内信号通路。

目前，治疗 DMD 的策略多样化，包括激素类药物、外显子跳跃技术、小分子化合物、基因疗法等。

其中，AAV 载体的包装容量有限（约 4.7 kb），所以大部分研究项目开发的 DMD 基因疗法均表达微营养不良蛋白（µDys）。如罗氏和 Sarepta Therapeutics 开发的基因治疗药物 Elevidys，产生的是一种缩短的蛋白质，大约 138 kDa，用于治疗 4 至 5 岁患有杜氏肌营养不良症 (DMD) 的儿童患者。

近日，来自华盛顿大学和海德堡大学医院的研究人员开发了一种利用分裂内含肽表达大型肌营养不良蛋白的新方法。内含肽是一种自剪接蛋白，可用于将两个或多个蛋白质片段连接在一起形成一个功能性蛋白质。相关文章以题为“Split intein-mediated protein trans-splicing to express large dystrophins”发表在Nature期刊。

这项研究由华盛顿大学医学院神经学家和遗传学家Jeffrey Chamberlain领导，他的实验室长期研究导致肌营养不良的机制、肌营养不良蛋白的结构和功能以及治疗方法。

为了通过两个或三个 AAV 的共同递送生成更大的肌营养不良蛋白，研究人员通过分裂内含肽的使用来连接两种蛋白质。研究人员鉴定了几对可以高效重组的内含肽，它们可以在双或三 AAV 载体递送后重建高度功能性的中肌营养不良蛋白（midi-Dys）或全长肌营养不良蛋白（full-Dys）。

结果表明，无论是在年轻或者年老的肌营养不良小鼠中，大型肌营养不良蛋白在骨骼肌和心肌中显示出更优越的治疗效果；该研究还证明了利用内含肽将三个不同的肌营养不良蛋白亚片段融合以在条纹肌中生成全长肌营养不良蛋白的可行性。

图 | Jeffrey Chamberlain（左）和 Hichem Tasfaout（来源：华盛顿大学）

此外，研究人员还证明低总剂量（每公斤 2 ×1013个病毒基因组）足以在全身横纹肌中表达大型肌营养不良蛋白，并对营养不良小鼠进行显著的生理矫正。数据显示，大型肌营养不良蛋白的功能明显优于正在临床试验中测试的微型肌营养不良蛋白。

研究人员表示，人体试验将在大约两年内开始，该技术也可应用于由大基因突变引起的其他遗传疾病。

但论文中也提到，需要进一步来确认这种方法的安全性。首先，当前研究中使用的分裂内含肽包含大约 125-150 个总氨基酸残基，所有这些序列都来自细菌，其细胞内半衰期未知；其次，每个蛋白不完全的表达，以及在患者细胞中内含肽“足迹”的重构蛋白的表达都有可能促成免疫反应；第三，外源性肌营养不良蛋白在肌营养不良蛋白缺乏细胞中的表达可能存在免疫原性。

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