中科院1区-Aging Cell | 芦丁改善巨噬细胞铁稳态失调诱导衰老相关的肾纤维化

衰老的巨噬细胞保留了一定程度的可塑性，使其易受与衰老相关的自噬、营养感知和线粒体功能障碍变化的影响。最近的研究表明，针对巨噬细胞的干预措施可以延长人类寿命并降低患衰老相关疾病的可能性。研究表明，限制热量摄入和使用代谢靶向药物（包括二甲双胍、白藜芦醇和雷帕霉素）等策略可通过影响巨噬细胞数量来影响寿命。因此，针对巨噬细胞功能为改善与衰老相关的炎症状态提供了一种可行的方法。

2024年7月17日，中山大学附属第三医院肾内科彭晖教授研究团队联合美国贝勒医学院胡兆永教授在Aging cell发表了题为“Macrophage iron dyshomeostasis promotes aging-related renal fibrosis”的文章，揭示了巨噬细胞参与衰老相关肾纤维化的新机制，并发现芦丁是减轻年龄相关性肾脏慢性低度炎症和纤维化的潜在治疗剂。

摘要

肾脏衰老以衰老细胞的积累和慢性低度炎症为标志，导致肾间质纤维化和功能受损。在本研究中，通过分析 8 周至 24 个月的 C57BL/6J 小鼠肾脏单细胞 RNA 测序数据，研究了炎症的关键调节因子巨噬细胞在肾脏衰老中的作用。研究结果阐明了肾脏衰老过程中肾脏细胞类型比例的动态变化，并揭示了巨噬细胞浸润增加会导致慢性低度炎症，这些巨噬细胞表现出衰老和铁死亡信号的激活。CellChat 分析表明，在衰老过程中巨噬细胞和肾小管细胞之间的通讯增强。抑制铁死亡可在体外减轻巨噬细胞介导的肾小管部分上皮-间质转化，从而减轻纤维化相关基因的表达。通过SCENIC分析，推断Stat1是一种关键的与年龄相关的转录因子，通过调节Pcbp1的表达来促进巨噬细胞铁失衡和铁死亡，Pcbp1是一种抑制铁死亡的铁伴侣蛋白。此外，通过从抗衰老化合物库中进行虚拟筛选和分子对接，构建了针对Pcbp1的对接模型，这表明天然小分子化合物芦丁可以通过保留Pcbp1来抑制巨噬细胞衰老和铁死亡。总之，研究强调了巨噬细胞铁失衡和铁死亡在肾脏衰老中的关键作用。研究结果还表明Pcbp1 是衰老相关肾脏纤维化的干预靶点，并强调芦丁是减轻年龄相关性肾脏慢性低度炎症和纤维化的潜在治疗剂。

1.巨噬细胞浸润促进肾脏衰老过程中慢性低度炎症

为了阐明肾脏衰老过程中各种细胞类型比例和功能的动态变化，分析了 C57BL/6J 小鼠肾脏的 scRNA-seq 数据。该数据来源于已发表的在线“细胞景观资源”（http://bis.zju.edu.cn/cellatlas/），涵盖了从 8 周到 24 个月的四个时间点（图 1a）。根据典型细胞类型特异性标志物的表达对细胞类型进行注释。在整个小鼠肾脏细胞景观中，鉴定出 17 种不同的细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞（图 1b）。这些细胞类型在肾脏的不同发育阶段和年龄中的比例不同，免疫细胞浸润显著增加（图 1c）。其中，巨噬细胞被确定为衰老肾脏中的主要免疫细胞类型（图 1d）。为了验证这些观察结果，分析了五只幼年（8周龄）和五只老年（24个月龄）C57BL/6J小鼠的肾脏。组织学分析证实衰老肾脏中免疫细胞浸润增加（图 1e，上）。使用F4/80标记物进行免疫染色进一步证实巨噬细胞积聚增加（图 1e，下）。此外，SASP 相关因子，包括 IL-6、TNF-α、IL-1β 和 MCP-1，在老年肾脏中上调（图 1f），表明肾脏衰老以慢性炎症为特征。以巨噬细胞为重点，进一步研究其在肾脏慢性炎症中的作用。基因集变异分析 (GSVA) 显示，巨噬细胞随着年龄的增长表现出炎症反应增强，在 24 月龄小鼠肾脏中达到与其他细胞群相比最高程度（图 1g、h）。免疫染色显示 IL-1β 与 F4/80 共定位，老年小鼠的 IL-1β 阳性巨噬细胞数量高于年轻组（图 1i）。这些生物信息学发现与实验证据相结合，表明慢性低度炎症是肾脏老化的特征，而巨噬细胞浸润的增加是导致该现象的重要原因。

图1 单细胞 RNA 测序数据显示肾脏衰老过程中巨噬细胞炎症增加

2 巨噬细胞在肾脏衰老过程中表现出衰老并发生铁死亡

认识到炎症在衰老过程中的重要作用，力求更深入地了解肾脏衰老过程中巨噬细胞的生物学变化。首先，选择了巨噬细胞簇，并确定了老年组（12、18 和 24 个月）与年轻组（8 周）相比的差异表达基因 (DEG)，分别发现了 398 个（12 个月）、311 个（18 个月）和 294 个（24 个月）DEG（图 2a）。尽管在不同年龄阶段的表达有所不同，但一些 DEG 是一致观察到的。具体而言，确定了 31 个重叠的 DEG，它们在衰老过程中持续上调，43 个重叠的 DEG 下调（图 2b）。KEGG分析显示，巨噬细胞中重叠的DEG与铁死亡（Pcbp1、Hmox1、Sat1）、谷胱甘肽代谢和细胞衰老密切相关（图 2c）。GO分析表明与活性氧反应、谷胱甘肽过氧化物酶活性和细胞对干扰素-γ的反应相关的途径富集（图 2d）。为了验证结果的可靠性，分析了另一个与肾脏衰老相关的单细胞测序数据集（Tabula Muris Senis，GSE109774）。蛋白质水平的免疫荧光染色验证了这些结果，显示衰老标志物 p21 与巨噬细胞标志物 F4/80 在老年肾脏中共定位，与在单细胞转录水平观察到的巨噬细胞衰老一致（图 2e，上图）。此外，脂质过氧化的生物标志物 4-羟基壬烯醛 (4HNE) 在老年肾脏巨噬细胞中显著升高，但在年轻肾脏中几乎没有检测到（图 2e，中图）。对铁吸收至关重要的转铁蛋白受体 (TFRC) 也与 F4/80 共定位（图 2e，下图）。总之，研究结果表明巨噬细胞在肾脏衰老过程中会发生衰老和铁死亡。

图2 单细胞RNA测序数据显示，巨噬细胞在肾脏衰老过程中表现出衰老和铁死亡

3 与衰老相关的肾脏纤维化相关的巨噬细胞和肾小管细胞之间的通讯增强

未解决的炎症被认为是纤维化疾病的核心问题，巨噬细胞在各种组织纤维化的病理生理过程中起着关键作用，包括肾纤维化，这是肾脏衰老的重要表现。老年肾脏表现出明显的间质纤维化，在肾小管间质区域观察到纤维化的增加（图 3a、b）。此外，细胞外基质蛋白（如纤连蛋白和胶原蛋白 I）在老年肾脏中的表达升高（图 3c、d）。基因集变异分析 (GSVA) 显示，与纤维化信号相关的 KEGG 基因集，例如 TGF-β、VEGF 和 WNT 通路，在巨噬细胞中随年龄增长而增加。同时，炎症通路，例如趋化因子信号通路和白细胞跨内皮迁移，也表现出对衰老的反应增加（图 3e，左）。相反，代谢相关通路，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢，随着年龄增长而减少（图 3e，右）。这些结果表明，巨噬细胞在肾脏衰老过程中保持促炎和促纤维化状态。最近的研究表明，铁积累会驱动肾脏纤维化、衰老和 SASP。分泌大量 TGF-β 的活化巨噬细胞可促进组织纤维化，包括脂肪组织纤维化。此外，肾小管细胞的部分上皮-间质转化 (EMT) 被认为是肾脏纤维化的另一种机制。为了进一步阐明巨噬细胞铁死亡信号在衰老相关肾脏纤维化中的作用，使用 CellChat 分析研究了肾脏衰老过程中巨噬细胞和肾小管细胞之间相互作用的变化。该分析表明，随着年龄的增长，巨噬细胞和肾小管细胞之间的相互作用增加（图 3f）。总之，这些发现表明巨噬细胞内发生了显著变化，可能导致促纤维化微环境和与衰老相关的肾脏纤维化。

图3 巨噬细胞和肾小管细胞之间通讯增强可能导致与衰老相关的肾脏纤维化

4 抑制铁死亡信号可抑制巨噬细胞介导的部分上皮-间质转化

鉴于人们对促纤维化微环境的认识日益加深，以及巨噬细胞和小管细胞之间细胞间通讯的增强，研究了抑制铁死亡信号是否可以抑制巨噬细胞介导的部分上皮间质转化 (EMT)。为此，建立了药物诱导的衰老细胞体外模型并进行了细胞共培养实验。过氧化氢 (H2O2 )处理模拟了氧化应激诱导的衰老，为研究细胞中的氧化应激反应提供了模型。博来霉素(BLM) 是一种化疗药物，由于其能够引起 DNA 损伤、破坏 DNA 代谢，因此也可作为细胞衰老的诱导剂。具体而言，用 300 μmol/L H2O2或 5 μg/mL BLM处理 RAW264.7 巨噬细胞以诱导衰老，导致 p21、γH2A.X 表达增加。这些结果证实了我们药物诱导的巨噬细胞衰老模型的建立。然后，探讨了 Ferrostatin-1 (Fer-1) 对巨噬细胞衰老的影响。Fer-1 是一种有效的铁死亡抑制剂，以其阻断脂质过氧化的有效性而闻名，脂质过氧化是游离铁催化的过程，对铁死亡的执行至关重要。Gpx4（谷胱甘肽过氧化物酶 4）是铁死亡途径中的关键酶。它通过将脂质氢过氧化物还原为脂质醇来防止铁死亡，从而抑制 Fe 2+依赖性活性氧 (ROS) 的形成。用 Fer-1 治疗可降低细胞亚铁离子水平和脂质过氧化 (LPO) 水平，同时增加谷胱甘肽 (GSH) 水平（图 4a-c）。此外，Fer-1 抑制 p21、MCP-1 和 IL-1β 的表达，同时刺激 Gpx4 表达（图 4d-f）。这些结果表明，抑制铁死亡信号传导可以减轻巨噬细胞衰老并降低炎症因子水平。最后，研究了抑制巨噬细胞中的铁死亡对肾小管细胞表型变化的影响。将 RAW264.7 巨噬细胞与 NRK-52E 肾小管细胞共培养，如图 4g所示。使用 H2O2或 BLM 在添加或不添加 Fer-1 的情况下诱导 RAW264.7 巨噬细胞衰老。彻底清洗后，将这些细胞与含有过滤器的 NRK-52E 细胞一起孵育 72 小时。如图4h所示，在存在衰老巨噬细胞的情况下，纤连蛋白水平会增加，但这种反应被 Fer-1 处理抑制。相反，在存在衰老巨噬细胞的情况下，观察到 E-钙粘蛋白水平降低，这表明小管细胞发生了 EMT，但 Fer-1 处理后这种反应发生逆转。此外，在存在衰老巨噬细胞的情况下，α-SMA、波形蛋白和 Snai1 等 EMT 标志物在 mRNA 水平上会增加，但在 Fer-1 处理后会降低（图 4i）。总之，抑制巨噬细胞中的铁死亡信号传导可以减轻小管部分上皮-间质转化，这表明存在一条减少或预防衰老肾脏纤维化的潜在途径。

图4 通过 Ferrostatin-1 抑制铁死亡信号可减轻巨噬细胞介导的肾小管上皮间质转化

5 巨噬细胞免疫衰老和肾脏衰老过程中铁死亡关键基因的鉴定

在确定铁死亡信号在巨噬细胞免疫衰老和年龄相关性肾脏纤维化中的关键作用后，旨在确定参与铁死亡过程的关键基因。ScRNA-seq 分析显示，随着年龄的增长，肾脏巨噬细胞中与铁死亡相关的基因（包括 Pcbp1、Hmox1 和 Sat1）的表达逐渐发生变化。具体而言，Pcbp1 和 Hmox1 的表达随着年龄的增长而降低，而 Sat1 的表达则增加（图 5a）。使用衰老巨噬细胞模型进行的体外研究证实了 Pcbp1 和 Sat1 的 mRNA 表达模式，而 Hmox1 的表达没有显著改变（图 5b）。进一步的功能相关性分析表明，Pcbp1 表达与活性氧途径、干扰素-γ 反应途径和白细胞跨内皮迁移途径的关联比 Hmox1 或 Sat1 更密切（图 5c）。此外，Pcbp1 蛋白表达随着衰老的进展而显著降低（图 5d）。由于 Pcbp1 作为铁伴侣发挥作用，能够以谷胱甘肽连接亚铁 (GSH-Fe II) 的形式携带和分配游离铁并促进各种生物氧化还原反应，推断 Pcbp1 是调节巨噬细胞铁死亡信号转导的关键抗铁死亡基因。

接下来，通过用 Pcbp1 siRNA 或 Pcbp1 过表达质粒转染细胞，然后用 H2O2和 BLM 刺激，探索了 Pcbp1 对巨噬细胞衰老的影响。图5e显示了敲低或过表达的效率 。Pcbp1 敲低导致 Gpx4 蛋白水平降低和 p21 蛋白水平升高（图 5f、g ）。相反，在 H2O2或 BLM存在的情况下，Pcbp1 过表达导致 p21 蛋白表达降低和 Gpx4 蛋白表达升高（图 5h、i)。这些发现表明 Pcbp1 是一种关键的抗铁死亡基因，可能为减轻与年龄相关的巨噬细胞免疫衰老提供新的治疗靶点。

图5 Pcbp1 是巨噬细胞衰老和铁死亡的核心基因

6 Stat1 作为调节肾脏衰老过程中巨噬细胞中 Pcbp1 的关键调节因子

为了了解衰老肾脏中的基因调控网络并识别出调节肾脏衰老过程中差异表达基因 (DEG) 的潜在转录因子 (TF)，进行了单细胞调控网络推断和聚类 (SCENIC) 分析。推断出巨噬细胞簇中的 TF 及其直接控制的基因（称为“调节子”）。SCENIC 分析产生了 52 个 TF 和 73 个调节子。选择了几个 TF 在图6a中突出显示 ，包括 Taf1、Gtf2f1、Yy1、Zmiz1、Etv6、Srebf2 和 Stat1。同时，我们调查了这些 TF 的 mRNA 表达，发现 Stat1 在 24 个月大的小鼠中显著上调（图 6b）。在 H2O2和 BLM诱导的巨噬细胞衰老模型中，Stat1 表达增加，与单细胞测序数据一致（图 6c）。无监督调节器分析表明 Pcbp1 位于 Stat1 的调节子内，表明它在巨噬细胞中直接受 Stat1 调控（图 6d）。值得注意的是，Stat1 调节子中的大多数基因都上调，但 Pcbp1 等几个基因在衰老过程中下调。这表明 Stat1 在衰老过程中可以充当转录激活剂或阻遏物。Stat1 靶标 DEG 的通路富集分析突出了其在 Fc gamma R 介导的吞噬作用、VEGF 信号通路、铁死亡、PPAR 信号通路、白细胞跨内皮迁移、细胞周期和细胞衰老中的作用（图 6e）。这些结果表明Stat1 充当控制老年肾脏巨噬细胞表型的上游枢纽。

进一步分析了 JASPAR 数据库中有关 Stat1 的信息，并可视化了共识序列“GAAA ... GAAACT”，可能是 Stat1 的结合位点（图 6f）。推断 Pcbp1 基因座启动子区域内有一个 Stat1 结合位点（图 6g）。ChIP 测定证实，Stat1 可以通过与 Pcbp1 启动子结合来调节 Pcbp1 的表达：在正常条件下，使用抗 Stat1 抗体在免疫沉淀中观察到富集的 Pcbp1 启动子 DNA 片段。然而，诱导巨噬细胞铁死亡的 BLM 治疗显著增强了这种反应，表明衰老刺激 Stat1 与 Pcbp1 启动子结合，导致 Pcbp1 表达下调（图 6h)。总之，结果表明Stat1 参与调节巨噬细胞铁死亡过程中 Pcbp1 的表达。

图6 SCENIC 分析显示 Stat1 是巨噬细胞衰老和铁死亡的关键转录因子

7 分子对接和虚拟筛选鉴定芦丁作为抗肾脏衰老的潜在药物

为了确定可以在铁死亡期间保护 Pcbp1 蛋白的潜在治疗方法，采用了计算机辅助药物筛选策略，使用包含 2154 种化合物的抗衰老化合物库，如图7a中的流程图所示 。使用 Maestro 11.9 平台中的标准分子属性工具来预测这些化合物的物理化学性质。经过筛选和筛选，确定了 2154 种化合物需要进一步分析。根据结合能分数和活性位点内的关键残基对这些化合物进行了评估，得到 20 种具有强结合能的化合物（对接得分 <-7）。值得注意的是，其中，芦丁的对接得分为 -12，表明具有强结合亲和力。这表明芦丁具有与 Pcbp1 有效相互作用的高潜力（图 7b）。芦丁与 Pcbp1 蛋白的分子对接以 3D 结构描绘（图 7c）。值得注意的是，芦丁与 Pcbp1 蛋白的特定口袋结合，通过常规氢键、碳氢键和疏水相互作用（烷基和 Pi-烷基相互作用）与苏氨酸 (THR)、亮氨酸 (LEU)、丝氨酸 (SER)、缬氨酸 (VAL) 和脯氨酸 (PRO) 相互作用。为了测试这种结合是否激活 Pcbp1，评估了芦丁对用 BLM 处理的 RAW264.7 巨噬细胞活力的影响。发现 40 至 60 μM 之间的浓度具有显著的保护作用，表明芦丁能够在衰老条件下保持 Pcbp1 功能（图 7d）。此外，芦丁处理可增加 Pcbp1 蛋白水平，表明它可以防止 Pcbp1 降解。因此，芦丁挽救了巨噬细胞衰老，这表现为用 BLM 和芦丁处理的巨噬细胞中 Gpx4 蛋白水平升高，p21 蛋白水平降低（图 7e）。因此，芦丁可能是调节衰老条件下 Pcbp1 功能的有前途的药物。此外，需要进行体内研究以确认这些影响并充分了解其治疗潜力。

图7 芦丁通过体外上调 Pcbp1 来预防巨噬细胞衰老和铁死亡

结论

总之，研究详细分析了巨噬细胞在肾脏衰老中的作用，证明了它们参与了衰老和铁死亡，从而导致衰老相关的肾脏纤维化。推断 Stat1 是 Pcbp1 的上游转录抑制因子，而 Pcbp1 是启动巨噬细胞铁死亡和炎症反应不可或缺的。体外观察到芦丁可能抵消免疫衰老和衰老相关的肾脏纤维化。这项研究为未来探索芦丁在临床环境中的潜力奠定了基础。

Wu L, Lin H, Li S, Huang Y, Sun Y, Shu S, Luo T, Liang T, Lai W, Rao J, Hu Z, Peng H. Macrophage iron dyshomeostasis promotes aging-related renal fibrosis. Aging Cell. 2024 Jul 17:e14275. doi: 10.1111/acel.14275.

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