Nature | 吴惊香课题组揭示去甲肾上腺素转运蛋白底物结合和抑制的结构机制

去甲肾上腺素（NA） 是一种重要的神经递质，在调节大脑和身体的活跃状态中起着至关重要的作用。NA系统的功能障碍可导致多种疾病的发生，包括交感神经过度活化、注意缺陷多动障碍 （ADHD） 、自主神经功能衰竭、应激、抑郁和嗜铬细胞瘤等。NET（去甲肾上腺素转运体） 能够将释放到突触间隙中的NA再摄取回突触前端，进而控制NA信号的强度和持续时间。NET异常与诸多疾病相关，是重要的成像及治疗靶标。目前，NET底物类似物被广泛用来诊断和治疗多种神经内分泌肿瘤、以及心脏病和帕金森病的诊断；各类NET抑制剂也在临床上发挥治疗ADHD、神经退行性疾病、药物滥用、焦虑和抑郁等疾病的作用。因此，阐明NET的底物转运机制以及药物抑制机制是该领域结构药理学的核心问题。

2024年8月14日，中国医学科学院药物研究所天然药物及核药基础与新药创制全国重点实验室吴惊香课题组在Nature在线发表题为Substrate binding and inhibition mechanism of norepinephrine transporter的研究论文。该研究解析了关键的神经系统疾病靶标——人源去甲肾上腺素转运体（Norepinephrine transporter,hNET）三个不同功能状态下的高分辨率结构，揭示了其底物识别及抑制剂抑制作用机制，为以NET为靶标的药物研发提供了结构基础。

为解决hNET小分子量蛋白结构解析困难的问题，研究人员在不影响蛋白表达和功能的基础上，创新性地引入PA标签系统，最终解析了hNET在无底物结合状态 （Apo） , 底物间碘苄胍 （MIBG） 结合和 (S,S)-羟基安非他酮 （radafaxine） 结合的三种不同功能状态的三维结构，分辨率在2.8-3.0埃之间。

hNET属于单胺类神经递质转运蛋白（Monoamine transporters;MATs） ，由12个跨膜螺旋组成，其中跨膜螺旋1-5和6-10形成一个结构类似的倒置重复，是转运底物的结构核心。此外，研究团队还观察到hNET与其它已解析的MATs家族成员结构不同，hNET胞内羧基端是由三个螺旋组成，与跨膜区有广泛的相互作用，显示出其羧基端的功能重要性。作者们发现无底物结合状态的hNET处于向内开口的构象，胞外门控处的氨基酸形成了多样的电荷互作和氢键网络，使得胞外门控处于紧密的关闭状态。

MIBG是底物NA的一种合成胍乙啶类似物，能够被NET摄取存储于突触前端。放射性核素标记的[123I]MIBG是交感神经系统放射性成像的金标准，能诊断和治疗多种神经内分泌肿瘤，比如儿童“癌症之王”——神经母细胞瘤。研究人员发现底物MIBG-结合状态的hNET同样是胞外门控紧闭且胞内门控打开，处于向内开口的构象，MIBG稳定地结合在底物结合口袋中心，通过氢键以及疏水作用等与hNET的A, B, C三个亚位点的氨基酸发生广泛的相互作用。由于NA和MIBG在结构和功能上的类似性，作者们推测NA也是以类似MIBG的方式结合在hNET的中心结合口袋上，这些信息为理解hNET的底物结合机制提供了结构基础。

Radafaxine是安非他酮 （Bupropion） 的一种活性代谢物，安非他酮可用来帮助戒烟和作为非典型抗抑郁药，用于治疗重度抑郁症障碍，是近几年来最常见的处方药之一。研究人员发现radafaxine-结合状态的hNET同样处于向内开口的构象，radafaxine占据了hNET的底物结合位点，通过与周围氨基酸形成π-π, 电子-π，氢键以及疏水作用等产生稳定的结合。Radafaxine完全占据了底物结合位点，阻止底物的进入，表明其是以正构抑制剂的形式发挥作用。与MAT家族已解析的其它构象的结构比较，radafaxine与外向开口的构象是有空间位阻的，作者推测radafaxine稳定hNET始终保持在内向开口构象，抑制其向向外开口构象转变，进而使hNET丧失转运活性。

图 hNET三种功能状态代表性结构、特征以及MIBG和radafaxine结合位点比较

综上，作者通过冷冻电镜对hNET三个不同功能状态的结构进行解析，发现hNET的整体结构类似于MATs家族成员；MIBG-结合的结构展示了hNET底物结合口袋的独特性，保证了其对NA特异性的摄取；radafaxine通过占据底物结合位点并可能阻止其构象变化来抑制hNET。这些信息为进一步理解hNET的机制和动态变化提供了坚实的基础，为以hNET为靶标的药物设计提供了关键信息。

值得一提的是，近期有三项研究分别独立解析了NET结合不同配体，在不同构象下的结构 （详见BioArt报道：；； ）【1-3】，这些研究各有特点，相得益彰，和本研究一起为对NET的底物识别、转运机制以及结构药理机制的理解提供了基础，为以 NET为靶标的药物治疗和设计提供了重要参考。

中国医学科学院药物研究所吴惊香研究员为该论文的独立通讯作者，研究生纪文明、缪安然，助理研究员梁凯以及研究生刘佳萌为本文共同第一作者。此外，药物研究所研究生祁宇涵和周悦，以及北京晶泰技术有限公司的段新丽、孙霁雪和赖力鹏也为本研究提供了帮助。同时，药物研究所王锐院士、崔冰研究员、李平平研究员、刘陆平研究员、汪小涧研究员以及生物分析中心为该工作提供了大力支持和帮助。

吴惊香课题组主要研究疾病相关靶标的工作机制和结构药理机制，助力药物研发。课题组目前招聘助理研究员、博士后和研究生，欢迎感兴趣的优秀青年加入。

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07810-5

制版人：十一

参考文献

1 Hu, T. et al. Transport and inhibition mechanisms of the human noradrenaline transporter.Nature, doi:10.1038/s41586-024-07638-z (2024).

2 Tan, J. et al. Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition.Nature, doi:10.1038/s41586-024-07719-z (2024).

3 Zhang, H. et al. Dimerization and antidepressant recognition at noradrenaline transporter.Nature630, 247-254, doi:10.1038/s41586-024-07437-6 (2024).

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