案例应用丨WOLF G2单细胞柔性分选系统用于富集转基因微藻

微藻是一类十分多样的生物，作为初级生产者发挥着至关重要的生态作用，并对水生光合作用做出了重大贡献。微藻也越来越多地被使用于生产可再生燃料、食品、保健品和其他生物制品。荧光细胞分选可用于在基础研究中富集所需的微藻种群，例如发现和分离新物种，以及为各种生物技术应用开发稳定的工程菌株。

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）可能是研究最深入的微藻，可以作为理解许多生物过程的模型，包括光合作用、叶绿体生物学，昼夜节律系统、碳浓缩机制和环境应激反应。此外，由于其单倍体基因组和易于培养生长的特性，莱茵衣藻更多的被科学家用作开发遗传工具的平台和生产各种产品的基底。我们使用衣藻作为样本证明了WOLF G2单细胞柔性分选系统的温和分选能力。有了这台仪器，我们可以将单个衣藻分选在96孔板中，表达GFP阳性目标细胞可以高度富集并能够保持高活力状态。

在每个实验之前测定衣藻的生长曲线，以确定莱茵衣藻的快速生长区间。下图为野生型和GFP表达型的生长曲线，数据表明，快速增长发生在第1天和第3天之间。因此，使用早期生长阶段的培养物进行分选实验。

分选前的衣藻样本中表达GFP的比例为10%至50%，总共设置了5组实验验证WOLF G2对不同目标细胞比例样本的富集效果。通过检测叶绿素自发荧光（FL5；B706）和GFP（FL1；B525）来区分活的莱茵衣藻细胞，流式圈门情况如下所示。叶绿素自发荧光信号的强度是藻类细胞活力的直接反映，通常WOLF G2单细胞柔性分选系统上莱茵衣藻信号高于104 decade表示活细胞，而低于104 decade的低信号表示应激/死亡细胞。

在三周的时间内进行了五次独立实验，大量富集GFP阳性的莱茵衣藻。五个样本是通过以不同比例将CC-4533（WT野生型）和CC-5416（GFP）细胞混合在一起制备得到。蓝条代表分选前藻类阳性细胞占比，绿色条代表富集后的GFP阳性细胞占比。误差线表示N=2个技术重复的标准偏差。

并且使用Novocyte流式细胞仪对GFP阳性莱茵衣藻进行富集后的阳性细胞占比的确认：A图为富集前的衣藻以9:1的比例混合（WT CC-4533:GFP CC-5416），B图为富集后的衣藻GFP细胞。

将GFP阳性细胞使用WOLF G2单细胞柔性分选系统和N1单细胞分配器进行单细胞分选，分选至96孔板。如下图展示，经过WOLF G2单细胞柔性分选系统分选后的单个衣藻细胞在培养三周后，依然有80%以上的细胞保持了高生长活力，并且长成了单克隆。长成的单克隆经过镜检验证了GFP荧光特性，下图中图A为分选的CC-5416的10x和40x明场图像，图B为10x FITC/GFP荧光图像。比例尺代表10倍和40倍物镜上的相对细胞大小。图像是在倒置回波显微镜上拍摄的。GFP荧光暴露时间为150毫秒。

通过上述富集和单细胞分选实验，以评估使用WOLF G2单细胞柔性分选系统富集活GFP阳性细胞的情况。证实WOLF G2单细胞柔性分选系统能够温和富集和单细胞分选活的GFP阳性莱茵衣藻细胞，并能够在培养三周后显示出高长成率。

高富集（>93%）效果和细胞高活力（>80%）的结合可以为科学家优化各种应用的工作流程，包括各种生物产品的稳定细胞系开发、生物燃料、物种/突变体分离和鉴定、组学研究、海洋监测、健康、新藻类物种的发现/分离等。

WOLF G2单细胞柔性分选系统体积小、便携、易于使用，非常适合野外作业。与传统的喷气式分选机相比，微流体系统提供了更温和的分选环境，是保存藻类细胞活力至关重要的理想选择。