【Cell】计算机设计可口服的微型蛋白 Th17 拮抗剂以治疗IBD

图 7 NSG-IBD 人源化小鼠结肠炎模型中 23R-91 的评估

白细胞介素IL -23和IL-17是自身炎症性疾病中经过充分验证的治疗靶点。针对IL-23和IL-17的抗体已显示出临床疗效，但受到成本高、安全风险、缺乏持续疗效以及需要肠胃外给药而给患者带来不便等限制。在这里，设计出了的抑制IL-23R和IL-17的微型蛋白，具有类似抗体的低皮摩尔亲和力。这些微型结合剂可在体外有效阻断细胞信号传导，并且极其稳定，可实现口服给药和低成本制造。口服IL-23R微型结合剂在小鼠结肠炎中显示出比临床抗IL-23抗体更好的功效，并且在大鼠中具有良好的药代动力学（PK）和生物分布特征。这项工作表明，从头设计可口服的微型结合剂可以穿过肠上皮屏障达到治疗目标。从头设计的微型结合剂具有高效力、肠道稳定性和简单的可制造性，是一种有前途的口服生物制剂形式。

1. 背景介绍

IL-23细胞因子由抗原呈递细胞产生，促进17型辅助T (TH17)细胞的分化和表型维持。IL-23刺激循环TH17以及组织驻留先天淋巴细胞(ILC)和ɣδT细胞中促炎细胞因子IL-17的产生。IL-23和IL-17是经过基因和临床验证的治疗靶点，可用于治疗多种TH17介导的自身炎症性疾病，包括炎症性肠病（IBD；IL-23）和银屑病（IL-23和IL-17)。然而，现有的抗体疗法有一些局限性。接受抗IL-23单克隆抗体(mAb) Stelara治疗的IBD患者中，只有约30%获得缓解，并且约20%的初始反应者随着时间的推移，由于抗药物抗体的产生而失去反应。全身免疫抑制使患者患恶性肿瘤和严重感染的风险增加。由于抗体分子较大，渗透性差，因此抗体不是口服给药，而是静脉输注或皮下注射，给患者带来不便和压力。全身给药的抗体通常表现出较差的组织渗透率，全身给药后在靶组织中仅达到血清浓度5%~10%。抗体的制造和分销非常昂贵，因为它们通常在哺乳动物表达系统中产生，需要复杂的纯化过程以达到适合肠胃外给药的纯度，并且需要冷冻储存和运输。

许多口服和局部蛋白质、肽和小分子正在开发中，作为全身施用抗体的方便、免疫原性较低、廉价的替代品。已批准的TNF-α抗体（阿达木单抗等）的口服版本在具有相同细胞效力的情况下提供更大便利，但需要专有制剂才能完整到达作用部位，而仅抗体的成本就已经很高了。口服JAK抑制剂已被批准用于治疗多种慢性炎症性疾病，包括IBD，但严重的副作用限制了其使用。口服肽正在开发用于治疗银屑病和IBD，靶向IL-23R（PN-235/JNJ-77242113，Protagonist Therapeutics和Janssen）和α4β7整合素（PN-943，Protagonist Therapeutics）。然而，这些肽需要非天然氨基酸和交联来赋予对胃肠道(GI)蛋白酶的抗性，因此需要通过化学合成进行昂贵的制造。正在开发针对银屑病的口服靶向IL-17A小分子（DC-806和DC-853，Dice Therapeutics和Eli Lilly）；虽然DC-853的亲和力尚不清楚，但DC-806仅以低纳摩尔亲和力结合IL-17A，并且需要两次相对较高的每日剂量才能达到适度的临床效果。虽然上述疗法比胃肠外施用的单克隆抗体更方便，但其安全风险、商品成本高和疗效有限是显着的缺点。

2. 结果与讨论

2.1 计算设计产生对 IL-23R 和 IL-17 具有低纳摩尔亲和力的微型蛋白质

IL-23由IL-23特有的p19亚基和与IL-12共有的p40亚基组成。IL-23受体也是异二聚体，具有结合 p19 的独特亚基 IL-23R 和结合 p40 的共享亚基 IL-12Rβ1。抗 p40 抗体 Stelara 可阻断IL-23 和 IL-12，已取得巨大的临床成功。然而，临床前研究表明，IL-23 而不是 IL-12 会驱动致病性自身炎症，因此，后续的药物发现工作主要集中在针对 IL-23 特异性亚基 p19。因此，作者的目标是设计破坏 IL-23R:p19 相互作用的蛋白质，以选择性抑制 IL-23 而不是 IL-12。IL-17A 和IL-17F 单体配对形成同二聚体 (A/A、F/F) 和异二聚体 (A/F) 细胞因子，通过与受体 IL-17RA 和 IL-17RC 的三元复合物发出信号。作者选择 IL-17A 作为初始设计靶标，因为它在 IL-17 同系物中最能确定为自身炎症性疾病的介质。这里的目标是设计在表面结合IL-17A 的蛋白质，介导其与 IL-17RA 或IL-17RC 的相互作用。

结合蛋白的计算设计从靶标的晶体或低温电子显微镜 (cryo-EM) 结构开始。如果配体结合结构可用，则可以将配体的关键结合残基（或热点）纳入设计中。如果只有目标的apo结构可用，则可以通过计算生成热点。作者采取了一种组合方法，使用来自 IL-23p19 细胞因子 (W156) 的一个天然热点和在 p19 界面生成的其他计算确定的从头热点进行种子设计。对于 IL-17A，使用专门的受体表面产生的从头热点。数以千计的计算设计的微型蛋白具有不同的拓扑结构和实验验证的稳定性（支架）停靠在 IL-23R 或IL-17A 表面，使得热点被纳入支架主干中。然后，以每个对接配置作为输入参数，使用 Rosetta 分子建模套件来优化 IL-23R 或 IL-17A 界面上的支架残基身份和构象，以实现高亲和力结合。天然和从头热点、支架疏水核心中的残基以及不在目标界面处的支架残基保持固定。根据与结合亲和力和单体稳定性相关的计算指标对设计的候选抑制剂进行筛选，获得编码每个靶点最佳 15,000 个的基因，并将其转化到酵母中进行表面展示。通过多轮连续的流式细胞分选(FACS) ，以及测序分析原始池和侯选池，并根据其相对富集或耗尽序列进行排序。

两种 IL-23R 设计（23R-1 和23R-2）以及三种 IL-17A 设计（17-1、17-2 和 17-3）在最终分类中高度富集，并被选择用于进一步的生化表征和测序优化。IL-23R结合设计是55个残基的-(23R-1)和54个残基(23R-2)的 3 螺旋束，包含一个包含天然 Trp 热点的中心结合螺旋，以及两个额外的螺旋，用于稳定中心结合螺旋并与 IL-23R 进行额外的接触（图 1A）。IL-17A 结合设计，43 个残基的 3-螺旋束17-2和 61 个残基的铁氧还蛋白 17-1 和 17-3，在 IL-17A 表面整合了模拟 IL-17RA 的从头生成的热点（图 1B） 。

图 1IL-23R 和IL-17A 微型结合剂的计算设计

微型结合剂的结合亲和力和效力通过生物层干涉测量法 (BLI) 和基于细胞的信号传导测定来确定。用 BLI 定量测定结合亲和力，所有设计均以低纳摩尔亲和力结合其靶标。在圆二色性 (CD) 实验中，微型粘合剂对热和化学变性剂（盐酸胍，Gdn）非常稳定。IL-23R 微型结合剂 23R-1 和 23R-2 的变性转变温度 (Tm) >95°C 和非常高的化学变性中点浓度（23R-1 为 5 M Gdn，23R-2 为>6 M；图 2C 和 2D）。IL-17A minibinder 17-1 的 Tm 约为 90°C，Gdn 变性中点为 4 M。IL-17A 微型蛋白 17-2 的稳定性最弱，Tm 约为 70°C，Gdn 变性中点为 2 M（图 3C）。微型结合剂以剂量依赖性方式阻断 IL-23 或 IL-17A 介导的细胞信号传导（图 2A、3A）。

图 2 IL-23R 微型结合剂的体外效力和稳定性

图 3 IL-17 微型结合剂的体外效力和稳定性

2.2饱和诱变数据证实了预测的单体结构和结合模式

探索所设计蛋白质的适应性构象可以深入了解其三维 (3D) 结构和结合模式。合成了包含23R-1、23R-2、17-1、17-2 和 17-3的所有可能的定点饱和诱变 (SSM) 文库，转化到酵母中，并筛选与标记的结合使用 FACS 检测目标蛋白。对原始池和侯选池进行深度测序，并计算侯选池中每个突变体的富集或耗尽作为结合适合度的估计。每个氨基酸每个位置的富集情况在二维 (2D) 热图中可视化（图 1C），蓝色框表示高度富集的突变，红色框表示高度耗尽的突变。计算每个微型结合剂的每个氨基酸位置的总体序列保守性得分，在位于富集热图上方的一维 (1D) 热图中可视化，颜色范围从浅灰色（低保守性）到深灰色（高保守性）。设计模型中对疏水核心或结合界面有贡献的位置是保守的（深灰色），而界面远端的表面位置不保守（浅灰色）。这些数据表明，微型结合剂像计算设计模型中那样折叠并结合目标。

2.3体外进化和计算设计极大地提高了效力和稳定性

口服蛋白质拮抗剂治疗剂在胃肠道条件下必须足够有效和稳定，才能以饱和靶标的浓度到达作用部位，并在这种情况下与天然配体竞争。因此，进一步寻求提高微型粘合剂的效力和对肠道蛋白酶的抵抗力。设计的组合文库包括 SSM 中高亲和力结合最富集的突变，并通过多轮连续的 FACS 选择高亲和力变体。使用单浓度 BLI 筛选，根据结合亲和力对亲和力优化的组合变体进行排序，并确定最佳变体的动力学和平衡结合常数。与亲本计算设计相比，亲和力最高的IL-23R 微型结合剂变体的结合亲和力高出 100 至1,000 倍，细胞效力高出 30 至 300 倍（图 2A）。亲和力最高的IL-17A 微型结合剂变体的亲和力和细胞效力（图3A）提高了约 60 倍。组合变体序列与亲本计算设计有15%–19% 的差异（8–10 个突变）。

使用 CD实验检测以及含有生理蛋白酶的模拟胃液和肠液（SGF 和 SIF）中的定时降解来评估结合剂的稳定性。亲和力优化的组合变体与它们的前体计算设计具有相似的耐热性和化学稳定性。与 23R-2 相比，23R-2 衍生的组合变体 23R-20 显示出相似的 SIF 稳定性，并适度降低了 SGF 稳定性（图 4A）。为了进一步提高微型结合剂的稳定性，同时保持高亲和力，在亲和力优化的组合变体中通过计算设计了分子内二硫键。在 IL-17A 组合变体17-35中添加一个二硫键（产生17-51）显著提高了稳定性，将 Tm 从大约 70°C 提高到 95°C，同样提高了对化学变性剂的耐受性（图 3C）。23R-64是 23R-1 的亲和力优化变体，添加了一个二硫键，显示出显着改善的 SIF 和 SGF 稳定性，半衰期(t1/2) 分别约为 30 分钟和4 小时，与 23R-1 相比，SIF 和 SGF 中 t1/2< 5 分钟（图 4A）。向 IL-23R 组合变体23R-20（产生23R-49）添加两个二硫键显著提高了SGF 稳定性，将全长 微型结合剂的t1/2 从大约 30 分钟增加到>24 小时，但降低了 SIF t1/2 的稳定性约为 5 分钟。为了进一步优化23R-64 和 23R-49，生成了 SSM 文库并转化到酵母中进行表面展示。

图 4 IL-23R 微型结合剂的体外和体内 GI 稳定性

稳定性最佳的变体23R-72 和 23R-91显示出 SIF 抗性的显著改善（图 4A），并保持或提高了效力（图 2A 和 2B）。23R-72包括三个精心挑选的突变（M1P、R8Q 和 K35W），这些突变在 23R-64 的 SIF 处理的SSM 中高度富集，并且共同将 SIF t1/2 从大约 30 分钟（23R -64) 至4–24 小时 (23R-72)，与 V565 相当（V565 是一种口服抗 TNF-α纳米抗体，处于IBD临床开发中，Sorriso Pharmaceuticals），在本测定中用作阳性对照（图 4A）。23R-72 对 IL-23R 的亲和力为 75 pM（图 2B），且细胞效力与前体 23R-64 相似（图 2A）。

稳定性优化变体23R-91，显示出改进的 SIF 稳定性，t1/2∼60分钟和出色的 SGF 稳定性(t1/2∼4-24小时；图 4A)。由于解离速率极慢，23R-91 的结合亲和力低于仪器的检测限（<1 pM；Biacore 8K）（图 2B），并且细胞效力略有提高（图 2B）。23R-72 和 23R-91 都对热和化学变性剂具有极强的耐受性，即使在 95°C 的 6 M Gdn 中，螺旋性的损失也极小（图 2C-D）。

2.4 23R-91的晶体结构与设计模型非常接近

最有效的 IL-23R 微型结合剂23R-91的晶体结构已解析至 1.9 Å 分辨率（图 5）。23R-91的晶体结构与设计的结构模型非常接近，几乎完美叠合。

图523R-91的晶体结构与设计模型非常接近

2.5 使用灵活的肽接头连接两个 hIL-17A 结合结构域，通过亲合力将效力提高 2,800 倍

另一方面，作者通过将两个 17-51与柔性肽接头连接(17-53) ，它比单体 17-51具有更高的亲和力（低皮摩尔，解离速率极慢[图 3B]）。与微型粘合剂单体 (17-51) 相比，效力增加了 2,800 倍，(图 3A) 。17-53在阻断hIL-17A 介导的信号传导方面的效力分别比临床单克隆抗体secukinumab和 bimekizumab 强 200 倍和 4 倍。17-53 对同源二聚体hIL-17A 具有高度特异性，对 hIL-17F 或hIL-17A/F 介导的细胞信号传导的抑制可忽略不计（图 3A）。

由于 hIL-17F 同二聚细胞因子也是临床相关靶标，因此筛选了 hIL-17A 微型结合剂组合文库与 hIL-17F 的交叉反应性，并通过体外进化进一步优化了与 hIL-17F 的亲和力和特异性。最有效的 hIL-17F 抑制剂17-40阻断 hIL-17F 介导的信号传导，其效力比 hIL-17A 特异性微型结合剂 17-51 强 300 倍，比secukinumab强 3 倍，比 bimekizumab 弱1,000 倍（图 3A）。

2.6 IL-23R 的 3–4 kDa 肽抑制剂可阻断 IL-23 介导的细胞信号传导

最高亲和力 7-8 kDa 微型结合剂的设计模型用于种子 3-4 kDa 变体的计算设计。分离出 7-8 kDa 微型结合剂中心结合螺旋的小片段，包括天然色氨酸热点和从头热点，然后将其移植到 26-32 个残基、结构验证的肽支架上。使用与上述 minibinder 设计工作流程相同的计算指标来过滤设计，合成编码前3,883个的基因，并将其转化到酵母中进行表面展示，并选择与标记的 IL-23R 结合，其中或无需在 SIF 中预孵育。
对三种最富集的设计（具有两个稳定二硫化物的26 个残基 EEH 折叠）的 SSM 分析表明，它们很可能通过设计的界面进行折叠和结合。疏水核心、结合界面处的残基和设计用于形成二硫键的半胱氨酸是保守的，而远离结合界面的表面位置不保守。最好的 26个残基 IL-23R 微型结合剂23R-101(3.2 kDa) 的效力是竞争性 IL-23R 拮抗剂肽 PTG-200 的 40 倍（Protagonist Therapeutics/Janssen）。然而，23R-101 的效力比最好的 7-8 kDa 微型结合剂 23R-91 低 30 倍，因此需要在靶组织中达到至少 23R-91 30 倍的浓度才能达到类似的功效。因此，作者还是优先考虑 7-8 kDa 微型结合剂以进行进一步的体外和体内表征。

这些结果提出了肽治疗发现的一般策略：设计更大的高亲和力微型结合剂，然后将关键的结合残基或基序移植到更小的结构化肽支架上。

2.7 微型结合剂（Minibinder）可阻断原代细胞培养物和人类类器官中IL-23 或 IL-17 介导的炎症

IL-23 和 IL-17A 拮抗剂用于治疗多种自身免疫性疾病，包括 IBD（仅限 IL-23）和牛皮癣（IL-17A和 IL-23）。IBD 的特点是肠道固有层 (LP) 局部炎症过程引起的肠道损伤。23R-91有效阻断来自结肠 LP 和附近肠系膜淋巴结 (mLN) 的细胞悬液中 IL-23 介导的细胞信号传导，这些细胞悬液是从健康大鼠中分离出来的，并用抗 CD3 和重组大鼠 IL-23 进行离体刺激（图 6A） ）。微型结合剂还阻断了大鼠脾细胞中的信号传导（图 6A）。同样，IL-23R 微结合剂阻断原代人 CD4+ T 细胞中 IL-23 介导的信号传导（图 6B）。

图 6 IL-23R和 IL-17 微型结合剂阻断原代细胞和源自人类皮肤细胞的类器官中的细胞信号传导

银屑病的特点是皮肤炎症，因此作者使用人类皮肤上皮产生的类器官来研究 IL-17A微型结合剂17-51的作用。培养类器官并用重组人IL-17A (15 nM) 刺激。将17-51 (75 nM) 与 IL-17A 同时添加到培养基中，或者在添加 IL-17A 后 1 或 3 小时添加到培养基中。孵育过夜后，通过 qPCR 分析类器官的下游标记物 CCL20、CXCL8 (IL-8) 和 S100A7。17-51 在所有条件下均显著抑制下游标记物的产生（图 6C）。

2.8 IL-23R 微型结合剂在大鼠口服给药后在胃肠道和血清中达到治疗相关浓度

肠道屏障的完整性可能会影响口服蛋白质疗法的药代动力学 (PK)。在患有活动性疾病的 IBD 患者中，屏障被破坏且渗透性更强，而缓解期患者的屏障更完整、渗透性更差。为了支持使用口服 IL-23R 微型结合剂作为患有活动性疾病的 IBD 患者的诱导治疗以及缓解期患者的维持治疗，作者研究了 23R-72 和 23R-91 在肠道屏障被破坏的大鼠中的药代特征。因为 IL-23R 微型结合剂与大鼠而不是小鼠 IL-23R 发生交叉反应。

在健康大鼠中，单次口服 20 mg/kg 剂量后 6 小时，在小肠内容物中检测到微结合剂浓度为 50–100 nM，在结肠内容物中未检测到，并且在小肠组织中检测到的微结合剂浓度 (40–200 nM) 高于结肠组织 (2–20 nM)（图 4C）。胃肠道保护载体（GPV；0.1 M 碳酸氢钠，200 mg/mL 脱脂奶粉）中的制剂不会显著影响内容物或组织中的微型粘合剂浓度；两种微型结合剂似乎对体内胃肠道蛋白酶具有相同的抵抗力。在健康大鼠的该剂量下，血清中未检测到微结合剂。健康大鼠单次口服较高剂量（140 mg/kg）后，给药后 15 分钟，血清中23R-91的浓度为 73 nM，此后血清浓度迅速下降，半衰期约为 15 分钟。3 至 24 小时内接近或低于检测限（图 4D）。
在TNBS大鼠中，通过口服管饲法施用23R-72，并通过导管将23R-91直接注射到盲肠中，模拟结肠释放制剂。每天三次 (TID) 20 mg/kg 给药 9 天后，在最后一次给药后 6 小时处死大鼠，并使用 ELISA 分析组织和血清中的微型粘合剂。两种微型结合剂在胃肠道组织中均达到低纳摩尔浓度，并且在口服或盲肠内给药后表现出较低的全身生物利用度，其浓度接近 mLN 或血清中测定的检测限(1–5 nM)。

2.9 在结肠炎人源化小鼠模型中，口服 IL-23R 微型结合剂与临床单克隆抗体一样有效

在结肠炎人源化小鼠模型中比较了口服 23R-91 与全身给药的 guselkumab 的疗效，guselkumab 是一种正在针对溃疡性结肠炎和克罗恩病进行 3 期临床试验的单克隆抗体（图 7A）。在此模型中，用 IBD 患者的外周血单核细胞 (PBMC) 重建缺乏 T、B 和自然杀伤 (NK) 细胞的 NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) 小鼠。表达 IL-23 和 IL-23R 的细胞主要来自人类，这能够研究 23R-91，它结合人类 IL-23R，但不结合小鼠同源物，以及竞争性临床（人类靶向）单克隆抗体。每天一次通过口服管饲法给予23R-91（8 或 80 mg/kg），腹膜内(i.p.) 注射给予Guselkumab (4 mg/kg)。评估研究终点，包括总体健康临床评分、结肠炎症宏观评分和结肠组织病理学（研究示意图图 7A）。

与未治疗的对照组相比，口服 8 和 80 mg/kg 的 23R-91 在疾病评分方面显示出统计上显着的改善，并且比腹膜内注射Guselkumab有更大的改善。（图 7B）。正如预期的那样，任何治疗都没有显着减少结肠纤维化。这些数据表明，口服23R-91（一种 7 kDa 蛋白质）在肠道上皮屏障之外的靶组织中达到足够的浓度以影响疾病。这是首次证明每日一次口服蛋白质药物可以在结肠炎模型中取得疗效。

8 mg/kg 的口服剂量在临床上是可行的，相当于平均体重（65 kg）的人服用含有 520 mg 活性成分的药丸。尽管 PK 和功效研究中使用的 20、80 和 140 mg/kg 剂量接近或超出了临床可行性的极限，但通过使用临床固体口服剂型（片剂），可以在较低 mg/kg 剂量下实现类似的摄取。与本文使用的简单地在PBS中配制的相对稀释的高容量液体剂量相比，其增加了局部腔内药物浓度。片剂或胶囊的常见聚合物包衣能够在所需的胃肠道隔室中进行位点特异性释放，可以进一步将药物集中在最佳吸收部位。

研究的局限性

尽管每日一次口服给药的微型结合剂23R-91在NSG-IBD结肠炎模型中显示出疗效，但口服给药后游离的23R-91很快从血液中清除。需要进一步的研究和开发来探索口服微型结合剂用于胃肠道和非胃肠道适应症，其中需要持续肠外抑制IL-23R。在PK和功效研究中都使用了高剂量的微型结合剂。应在临床前物种中评估固体口服剂型，以增加最佳摄取部位的腔内微型粘合剂浓度，从而减少所需剂量，以支持口服微型粘合剂的临床使用。此外，尚未证明IL-17微型结合剂的体内功效；这些额外的研究将增强微型粘合剂作为口服生物方式的普遍性。

此外，本文筛选的片段还是非常主要依赖于展示技术、以及8KDa到4KDa的优化并不成功。

参考：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.052IF: 45.5Q1

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