热点剖析：RNA 修饰-m7G 发生机制及研究方法

来源：青椒医学

RNA 甲基化是目前研究最广泛的 RNA 表观遗传修饰，目前已有包括 N7 甲基鸟苷甲基化（m7G）在内的 70 余种 RNA 甲基化修饰方式被发现并报道。

m7G 甲基化作为一种普遍存在且进化保守的 RNA 修饰，在早前的研究中被认为主要发生在真核细胞 mRNA 的 5′ 端鸟苷 N7 位点，介导转录延长、mRNA 剪接、出核和翻译等过程。m7G 修饰通过影响各种 RNA 分子的代谢，包括 mRNA、tRNA、microRNA 和核糖体 RNA。越来越多的证据表明，m7G 在人类疾病的发展中发挥着关键作用。

目前 m7G 中标的项目越来越多，但又不会像其他热点一样被研究的很泛滥，因此不失为基金申请的好方向。 下面本文将从背景介绍、研究手段、方法、结果分析等角度深入解析这一主题。

一、背景介绍：m7G 是什么？

7-甲基鸟嘌呤（m7G）修饰是一种常见的 RNA 修饰，主要存在于 tRNA、rRNA 和 mRNA 中，对 RNA 的稳定性、翻译效率和功能有重要影响。

概念

m7G 修饰是指在 RNA 分子中的鸟嘌呤（G）碱基的第七位氮原子上加上一个甲基基团，形成 7-甲基鸟嘌呤（m7G）。这种修饰可以发生在 RNA 分子的不同位置，如 mRNA 的 5' 端帽子结构、tRNA 的反密码环和 rRNA 的特定位置。

原理

m7G 修饰通过酶促反应实现，这些酶通常被称为甲基转移酶。甲基转移酶使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将甲基基团转移到鸟嘌呤的第七位氮原子上，生成 m7G。

m7G 在 RNA 中修饰的过程和位点

机制

m7G 修饰在不同类型的 RNA 中发挥着多种生物学功能：

1. mRNA 中的 m7G 帽子结构：

• 功能：mRNA 的 5' 端帽子结构（m7GpppN）是 eukaryotic mRNA 的典型特征，保护 mRNA 不被核酸外切酶降解，促进 mRNA 的核输出，参与翻译起始，并影响 mRNA 的转录和加工。

• 合成：mRNA 帽子的合成由一系列酶促反应完成，包括 RNA 三磷酸酶、鸟嘌呤转移酶和甲基转移酶。这些酶协同作用，最终在 mRNA 的 5' 端形成 m7G 帽子结构。

2. tRNA 中的 m7G 修饰：

• 功能：tRNA 中 m7G 修饰主要发生在反密码环区域，影响 tRNA 的结构和稳定性，促进正确的密码子-反密码子配对，提高翻译的准确性和效率。

• 合成：tRNA 中 m7G 的形成由特定的 tRNA 甲基转移酶（如 Trm8-Trm82 复合物）催化，这些酶识别特定的 tRNA 底物并进行甲基化修饰。

3. rRNA 中的 m7G 修饰：

• 功能：在 rRNA 中，m7G 修饰参与核糖体的组装和功能，影响蛋白质合成的精度和效率。

• 合成：rRNA 中的 m7G 修饰由 rRNA 甲基转移酶（如 Bud23）催化，这些酶在 rRNA 的特定位点进行甲基化修饰。

生物学意义

m7G 修饰在 RNA 代谢中发挥着关键作用，具体表现在以下几个方面：

• RNA 稳定性：m7G 修饰保护 RNA 分子免受降解酶的作用，增加 RNA 的半衰期。

• 翻译调控：m7G 帽子结构与翻译起始因子结合，促进翻译起始复合物的组装，提高翻译效率。

• RNA 加工与核输出：m7G 帽子结构在 RNA 加工和核输出过程中发挥重要作用，影响 RNA 的成熟和运输。

m7G 调节因子在各种肿瘤中的作用

研究进展

近年来，随着高通量测序技术和质谱分析技术的发展，人们对 m7G 修饰的分布、功能和调控机制有了更深入的认识。例如，研究发现 m7G 修饰在癌症、神经退行性疾病和病毒感染等病理过程中起重要作用，成为潜在的疾病标志物和治疗靶点。

二、研究手段与方法：m7G 如何研究？

m7G 的研究涉及多种技术手段和检测指标，以解析其复杂的生化途径和调控机制。以下是一些关键的研究方法和技术：

1. 传统生物化学方法

• 薄层层析（TLC）：

  i）原理：薄层层析通过将样品在涂有吸附剂的薄层板上进行展开，不同化合物在薄层板上的迁移率不同，从而实现分离和检测。

  ii）应用：m7G 修饰的 RNA 在薄层层析板上有特定的迁移率，通过与标准品对比可以进行定性检测。

• 高效液相色谱（HPLC）：

  i）原理：高效液相色谱通过液相移动相和固定相之间的相互作用分离混合物中的成分。

  ii）应用：可以用于分离和纯化 m7G 修饰的 RNA 片段，通过与标准品的保留时间进行比较，实现 m7G 修饰的定性和定量分析。

• 质谱（MS）：

  i）原理：质谱通过测量离子的质荷比（m/z）来分析化合物的结构和组成。

  ii）应用：与液相色谱（LC-MS）或气相色谱（GC-MS）联用，可以精确检测 m7G 修饰的存在和位置，提供高灵敏度和高特异性的检测结果。

2. 分子生物学方法

• 免疫荧光检测：

  i）原理：利用特异性抗体结合 m7G 修饰，通过荧光标记检测抗体-抗原复合物。

  ii）应用：适用于细胞和组织切片中 m7G 修饰的定位和定量分析，可以通过共聚焦显微镜观察修饰的空间分布。

• 酶联免疫吸附测定（ELISA）：

  i）原理：利用 m7G 特异性抗体结合修饰核苷酸，通过酶标记检测抗体-抗原反应。

  ii）应用：适用于大规模样品的高通量筛查，可以提供定量结果。

3. 高通量测序技术

• m7G-seq：

  i）原理：结合特异性抗体富集 m7G 修饰的 RNA 片段，然后进行高通量测序。

  ii）应用：可以在全基因组水平上检测 m7G 修饰的分布和频率，提供修饰在不同 RNA 分子中的精确位置。

• RIP-seq（RNA 免疫共沉淀测序）：

  i）原理：使用特异性抗体对 m7G 修饰的 RNA 进行免疫共沉淀，然后进行 RNA 测序。

  ii）应用：适用于研究 m7G 修饰与特定蛋白质的相互作用，分析修饰对 RNA 功能的影响。

• MeRIP-seq（甲基化 RNA 免疫共沉淀测序）：

  i）原理：使用抗 m7G 抗体进行甲基化 RNA 的富集，然后进行高通量测序。

  ii）应用：广泛用于检测 mRNA 中 m7G 修饰的全局分布，揭示修饰的调控机制和生物学功能。

4. 新兴技术

• 纳米孔测序（Nanopore Sequencing）：

  i）原理：通过纳米孔阵列直接测序单分子 RNA，检测通过纳米孔的电流变化。

  ii）应用：纳米孔测序技术能够直接读取 RNA 分子的序列和修饰状态，实现单分子水平的 m7G 修饰检测，提供高分辨率和高灵敏度的数据。

• 单分子荧光共振能量转移（smFRET）：

  i）原理：利用荧光染料标记 RNA 分子，通过共振能量转移检测分子间的距离变化。

  ii）应用：可以用于实时监测 m7G 修饰的动态变化，研究修饰对 RNA 结构和功能的影响。

三、结果分析：m7G 实验结果怎么看？

下面举 2 个例子带大家一键看懂 m7G 实验结果。

1. Cancer Research｜WB 检测到仑伐替尼耐药细胞中的 tRNA m7G 修饰水平升高

图源：Cancer Research

在这张图片中，显示了两种肝癌细胞系（Huh7 和 PLC/PRF/5）在两种不同条件下（Par 即对照组和 LR 即仑伐替尼耐药组）的几种蛋白的表达水平，这些蛋白包括 WDR4、METTL1、GAPDH（作为内参蛋白）、m7 G（7-甲基鸟苷），以及 U6（用作另一种内参）。Western Blot 的条带黑度反映蛋白的相对量，数值则提供了量化的比较。

• 检查内参蛋白表达稳定性：

  GAPDH 和 U6 通常用作内参，确保实验中蛋白质加载量的一致性。对比 GAPDH 和 U6 的表达稳定性来判断实验的可靠性。例如，Huh7 细胞中 GAPDH 在 Par 和 LR 之间表达变化不大，而 U6 表达在 LR 中略有下降。PLC/PRF/5 中 GAPDH 表达在 LR 稍微下降，U6 则在 LR 中略微上升。

• 分析目标蛋白表达变化：

  WDR4 和 METTL1 在两种细胞系中对仑伐替尼耐药的反应不同。Huh7 中 WDR4 在 LR 组大幅上升（从 0.18 增至 3.76），METTL1 也有所增加（从 0.54 增至 1.80）。PLC/PRF/5 中，WDR4 和 METTL1 的表达量同样在 LR 中增加，但幅度较小。

• 重点分析 m7G 表达：

  m7G 的表达在两种细胞系的 LR 组中均显著上升，这表明仑伐替尼耐药细胞可能增强了 tRNA 的 m7 G 修饰。Huh7 中 m7 G 从 3.22 增至 4.75，PLC/PRF/5 中从 3.96 增至 4.43。这可能指示 m7 G 修饰在耐药机制中的潜在角色。

2. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research｜RNA dot blot 检测发现与 LNCaP 细胞相比，LNCaP-AI 和 C4-2 细胞中 mRNA 内的 m7 G 修饰水平更丰富

图源：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

图片分为两个 (A) 和 (B) 两部分，每部分都有两张图，分别是 m7G dot blot（m7G 斑点印迹）和 Methylene blue（亚甲蓝）染色。

A 部分（LNCaP-AI 和 LNCaP 细胞）

• 上图： m7 G dot blot

  每列表示不同细胞系：LNCaP-AI 和 LNCaP。 每行表示不同量的 RNA 样品： 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng。

  m7G 信号：LNCaP-AI 细胞的斑点明显比 LNCaP 细胞的斑点更暗，表示 LNCaP-AI 细胞中 m7G 修饰水平更高。

• 下图：Methylene blue 染色

  作为对照，显示加载的 RNA 总量是否相同。 各个点的染色强度相似，说明加载的 RNA 量基本一致，验证了上图检测结果的可靠性。

B 部分（C4-2 和 LNCaP 细胞）

• 上图：m7G dot blot

  每列表示不同细胞系：C4-2 和 LNCaP。 每行表示不同量的 RNA 样品： 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng。

  m7G 信号：C4-2 细胞的斑点明显比 LNCaP 细胞的斑点更暗，表示 C4-2 细胞中 m7G 修饰水平更高。

• 下图：Methylene blue 染色

  同样作为对照，显示加载的 RNA 总量是否相同。 各个点的染色强度相似，说明加载的 RNA 量基本一致，验证了上图检测结果的可靠性。

• 定性分析： 从 m7G dot blot 图中可以看出，LNCaP-AI 和 C4-2 细胞的 m7G 信号明显强于 LNCaP 细胞，表明 LNCaP-AI 和 C4-2 细胞中的 m7G 修饰水平更高。 Methylene blue 染色图显示每个点的染色强度基本一致，验证了 RNA 加载量的一致性，确保了 m7G 信号差异是由于修饰水平不同，而非 RNA 加载量不同。 进一步的定量分析可以通过斑点的灰度值进行定量，利用图像分析软件（如 ImageJ）测量每个斑点的灰度值，计算不同细胞系间 m7G 修饰水平的相对变化。

四、国自然中标统计：m7G 热度如何？

2023 年医学科学部「m7G」中标项目 9 个，其热度逐渐攀升

部分中标项目

总而言之，m7G 修饰在 RNA 稳定性、翻译效率和功能调控中发挥关键作用，近年来成为 RNA 修饰研究的热点。通过高通量测序和质谱分析等技术，科学家们深入解析了 m7G 的分布和机制，揭示其在癌症、神经退行性疾病和病毒感染等病理过程中的重要性。未来，m7G 修饰研究有望为疾病诊断和治疗提供新的靶点和思路，推动 RNA 生物学和医学领域的重大进展。

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