CRISPR/Cas9技术在细胞报告系统中的应用：监测胎儿血红蛋白表达

胎儿血红蛋白（HbF）表达的再激活一直是治疗β-球蛋白病患者的药物发现工作的重点。随着CRISPR基因治疗的出现，HbF表达的再激活已成为一种有希望的治疗方法。为了测试潜在的HbF诱导剂，人们亟需一个能够在大量化合物中快速识别出潜在的HbF诱导剂的敏感、特异且高通量的筛选系统。在这种状况的驱动下，许多研究人员期望创建一个新的细胞报告系统来报告内源性HbF表达。最近，一组荷兰、德国和日本联合的研究人员成功开发这种细胞报告系统，其研究成果“A cellular reporter system to evaluate endogenous fetal hemoglobin induction and screen for therapeutic compounds”发表在HemaSphere（IF：12.1）杂志上。

球蛋白病，包括镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血在内的单基因遗传疾病，通常在个体出生后由胎儿血红蛋白（α2，γ2）转变为成人血红蛋白（α2，β2）时开始表现症状。自1948年首次发现血红蛋白转换与症状发作的关联，重新激活HbF表达便被视作潜在的有效治疗策略。尽管羟基脲作为唯一获批的HbF表达诱导剂，其疗效在患者间差异显著，部分患者甚至无反应，凸显了新药开发的紧迫性。此前研究受限于缺乏能报告内源性HbF表达的细胞系，阻碍了新诱导剂的评估。该研究中，研究人员采用CRISPR/Cas9技术在HUDEP2成人红细胞前体细胞系中嵌入生物发光标签，创建了首个内源性标记的胎儿血红蛋白报告细胞系，并用其评估遗传和药理策略对HbF表达的诱导效果，同时筛选可能的HbF诱导剂。

一、HBG1特异性CRISPR-Cas9 gRNA设计的序列分析

胎儿γ-球蛋白链是通过两个高度同源且紧密相邻的基因HBG1和HBG2编码的。鉴于Cas9可能同时在这两个基因上引起双链断裂，导致基因组重排，CRISPR-Cas9技术在内源性胎儿γ-球蛋白链的标记中必须使用特异性gRNA，以避免影响HBB位点上的其他β样球蛋白基因。研究人员首先对HBG1基因（Aγ球蛋白链）的序列进行了详尽分析，包括与HBG2（Gγ珠蛋白链）在人类参考基因组GRCh38中的3'-UTR区域的比较，以及HUDEP2细胞中的基因特异性PCR扩增子测序。分析揭示了HBG1 3'-UTR区域在位置+17的独特核苷酸和位置+55的额外腺嘌呤，以及HUDEP2细胞中3'-UTR的基因特异性核苷酸。利用这些信息，研究人员设计了两个特异性针对HBG1 3'-UTR的gRNA，并通过克隆到表达质粒并转染至HEK293T细胞来评估其DNA切割效率，TIDE算法分析显示gRNA #2效率最高。

图1 在HUDEP2细胞中特异性靶向HBG1 3‘-UTR的gRNAs设计

二、标记HUDEP细胞中的内源性HBG1基因

在尝试特异性标记HUDEP细胞系中的内源性HBG1基因之前，研究人员首先在类似胎儿的HUDEP1细胞中验证了CRISPR-Cas9系统介导的HBG1基因标记的可行性。通过共转染含有eGFP报告基因的双链DNA模板和Cas9_gRNA #2质粒，他们进行了基因编辑尝试。流式细胞术检测显示敲入效率较低（GFP阳性细胞不足1%），但FACS成功富集了正确编辑的细胞。DNA序列分析确认了eGFP标签在HBG1基因中的准确插入。为提高敲入效率，研究人员在HUDEP2细胞中采用单链DNA模板和改进的Cas9-gRNA递送方法（RNP代替质粒），将HiBiT标签引入Aγ-球蛋白C末端，使敲入效率提升至超过20%。蛋白免疫印迹分析和HiBiT发光信号检测证实了标签的特异性和敲入效率。最终，研究人员成功在HUDEP2细胞中建立了含有HiBiT标签的报告细胞系，并经过分子特性和高通量筛选的验证。

图2 HBG1基因的c端标记

三、Aγ-HiBiT报告细胞系在增殖和分化方面与HUDEP2细胞相似

为了确认新创建的Aγ‐HiBiT报告细胞系在生物学行为上与原始的HUDEP2细胞系是否具有相似性，特别是在细胞增殖和分化这两个关键的细胞过程，研究人员进行了系列验证。通过序列分析确认，Aγ‐HiBiT报告细胞系在其HBG1基因的A−等位基因上含有一个HiBiT标签的嵌入，而在A+等位基因上观察到一个插入突变，保留了TGA终止密码子。SNP阵列分析结果显示，报告细胞系除了HUDEP2细胞已知的染色体三体性（6, 8, 18, 19, 21号染色体）之外，还额外获得了7号染色体的副本。通过ATAC测序分析，他们发现报告细胞系在HBB位点的开放染色质模式与HUDEP2细胞相似，且HBE、HBG1和HBG2基因区域没有ATAC信号，表明这些基因仍然被有效沉默。对相关RNA进行测序，结果显示报告细胞系的转录活性限于成人HBD和HBB基因，与HUDEP2细胞的表达模式相似。此外，他们还比较了报告细胞系和HUDEP2细胞中已知的52个HbF调节因子的表达水平，对分化过程中的细胞表型变化进行分析。这些实验最终呈现的结果综合证实了Aγ‐HiBiT报告细胞系在分子和细胞层面上与HUDEP2细胞具有高度的相似性。

图3 Aγ-HiBiT报告细胞系的特性分析

四、应用Aγ-HiBiT报告细胞系评估遗传HBF-诱导策略

建立Aγ‐HiBiT报告细胞系后，研究人员探讨了其在评估遗传性HbF诱导策略中的应用，旨在深入理解HbF表达的调控机制并促进新治疗策略的开发。他们首先验证了该细胞系在CRISPR-Cas9基因编辑中的存活能力，利用Cas9引导的gRNA在HBG1和HBG2基因的启动子区域引入了与HPFH相关的13 bp缺失。基因组编辑后，报告细胞和对照HUDEP2细胞中γ-珠蛋白水平上升，蛋白免疫印记分析揭示了HiBiT标记及未标记的γ-珠蛋白链的存在。HPLC分析表明，基因编辑显著提升了报告细胞中HbF的比例，从2.3%增至23.1%。此外，研究还探索了通过破坏BCL11A红细胞特异性增强子的遗传策略，HiBiT Lytic Assay结果显示两种遗传方法均显著增强了HiBiT信号。

图4使用Aγ-HiBiT报告细胞来评估遗传性胎儿血红蛋白的诱导

五、泊马度胺作为HbF诱导的阳性对照化合物

为了发现能够诱导γ-珠蛋白表达的化合物，研究人员选择了泊马度胺作为诱导HbF的阳性对照化合物，并用其处理了健康捐赠者的原代红细胞前体细胞，以及来自镰状细胞病患者的原代红细胞前体细胞，以评估其对HbF表达的影响。首先，研究人员通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹分析，评估了泊马度胺处理后γ-珠蛋白mRNA和蛋白的表达水平。实验结果显示，泊马度胺处理可以显著增加原代红细胞前体细胞中HbF的水平，无论是在增殖条件下还是在分化条件下。此外，在进行化合物筛选时，化合物对细胞活力的影响也是研究人员需要考虑的因素。在发现泊马度胺在一定浓度范围内对细胞活力没有显著毒性后，研究人员测试了不同浓度的泊马度胺对Aγ-HiBiT信号的影响，发现存在剂量依赖性的增加，并估算了EC50值。为了验证泊马度胺是否特异地激活HbF，研究人员还测试了在分化条件下泊马度胺的效果，并与细胞毒性化合物进行了对比，以确保HbF的诱导不是由于细胞应激反应。

图5 使用泊马度胺作为胎儿血红蛋白（HbF）诱导的阳性对照

六、报告细胞系与HTS兼容

为了验证Aγ‐HiBiT报告细胞系是否适用于高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS），研究人员们进行了Aγ‐HiBiT报告细胞系与HTS的兼容性验证。在确定适合于高通量筛选（HTS）的Aγ‐HiBiT报告细胞系的培养条件后，研究人员在384孔板中测试不同的细胞接种密度，发现10,000至15,000个细胞每孔能够在3天内线性增殖。接着，研究人员使用泊马度胺的不同浓度对细胞进行处理，以测试Aγ‐HiBiT信号的剂量依赖性反应。针对自动化读取过程中出现的问题，他们优化了实验操作，包括减少裂解缓冲液的体积和调整添加速度。通过筛选一个包含5632种已知化合物的库，研究人员们验证了Aγ‐HiBiT报告细胞系在HTS中的适用性。在筛选中成功鉴定了已知的HbF诱导剂地西他滨（Decitabine），以及其他核苷酸类似物，证明了细胞系在识别HbF诱导剂方面的有效性。通过DMSO溶剂毒性研究，研究人员确定了Aγ‐HiBiT报告细胞系对DMSO溶剂的敏感性，并建议在HTS中使用低浓度DMSO以避免影响细胞活力。这些实验结果最终证实Aγ‐HiBiT报告细胞系与HTS兼容，并可以作为一个强大的工具用于无偏地识别新的HbF诱导化合物。

图6 Aγ-HiBiT 报告细胞系适用于旨在检测 HbF诱导的HTS应用

综上，这项研究报道了一个创新的Aγ‐HiBiT报告细胞系的开发，该细胞系利用CRISPR-Cas9基因敲入技术在成人红细胞前体HUDEP2细胞中特异地标记了胎儿血红蛋白（HbF）基因。这一系统能够高灵敏度和特异性地监测内源性HbF的表达，适用于高通量药物筛选，以鉴定新的HbF诱导剂。这项工作为β-球蛋白病的治疗研究提供了新的工具，有助于推动新治疗方法的发展。