Cell：刚发完 Nature，张锋院士基因编辑领域再获重磅突破

来源：丁香学术

2013 年，张锋等科学家首次将 CRISPR-Cas9 技术应用于哺乳动物细胞，是基因编辑领域中里程碑式的进展。时隔十年，2023 年 6 月 28 日，美国 Broad 研究所/麻省理工学院张锋团队（Makoto Saito 和徐沛雨为论文共同第一作者）在Nature杂志发表研究论文，在真核生物中发现了第一个 RNA 引导的 DNA 切割酶-Fanzor，与 CRISPR-Cas 系统相比，其广泛存在于真核生物中，没有旁系切割活性，不仅更容易递送到细胞和组织中，而且能够实现更精准的基因编辑，一定程度上弥补了 CRISPR-Cas 的不足之处。

来源：Nature

2024 年，张锋院士团队在基因编辑领域的重磅研究令人瞩目。5 月 29 日，张锋院士团队与其合作者在Nature杂志发表研究论文 Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor，展示了 SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA 复合物在不同构象状态下的冷冻电镜结构。

8 月 6 日，张锋团队在Molecular Cell发表研究论文 Structural determinants of DNA cleavage by a CRISPR HNH-Cascade system，描述了 Selenomonas sp. HNH-Cascade (SsCascade) 与靶 DNA 复合物的冷冻电镜结构，表征了其作用机制。

图源：Molecular Cell

2024 年 8 月 28 日，张锋团队（徐沛雨和 Makoto Saito 为论文共同第一作者）再接再厉，在Cell杂志发表研究论文 Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor，该研究首次展示了 Fanzor(Fz) 蛋白在不同生物中所表现出的分子多样性，深入解析了其通过 RNA 引导的 DNA 切割机制。且首次揭示了 Fz1 蛋白的激活和裂解机制，阐明了促进其作为 RNA 引导的内切酶功能的结构转变，为基因工程改造和开发奠定了技术基础。

来源：Cell

1. 三种物种中不同构象状态下的 Fanzor 冷冻电镜结构

Fanzor 蛋白主要存在于原口菌、藻类、真菌和单细胞真核生物中，由 Fz1 和 Fz2 两个蛋白家族组成。那么在不同物种中，Fz1 蛋白会有什么特点呢？研究团队克服巨大的技术障碍，首先通过冷冻电镜解析了来自不同物种的 Fz1 蛋白以及不同构象下的 13 个结构，包括来自藻类 Guillardia theta 的 GtFz1、真菌 Spizellomyces punctatus 的 SpuFz1 和寄生真菌 Parasitella parasitica 的 PpFz1。

例如，研究团队获得了 6 个不同 DNA 结合状态下的 SpuFz1 复杂结构，分辨率从 2.9 Å 到 3.4 Å 不等。以 4 种不同构象下的 PpFz1-uRNA-DNA 复合物结构为例，其分辨率从 3.2 Å 到 3.5 Å 不等。从结构细节可以发现，在三个物种的所有 Fz1s 结构中，蛋白质与 RNA 相互作用的界面是相似的，这表明在不同的 Fz1s 之间存在一种保守的 RNA 引导的 DNA 靶向机制。

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研究思路：结构决定功能，为揭示真核基因编辑系统 Fanzor 的功能，首先要获得不同状态下 Fanzor 的结构，寻找其共同点和不同点，为解析相关机制做准备。

2.Fanzor 的共同特征和结构多样性

Fz1 蛋白的共同特征和结构多样性是什么呢，其保守的 DNA 靶向机制具体是什么？研究团队发现 Fz1 主体蛋白大多由 600-700 个氨基酸组成，具有相对保守的结构域。这三种 Fz1 蛋白的整体结构显示出显著的相似性，它们都具有双叶结构特征，并以类似的方式容纳 wRNA 和目标 DNA，与 TnpB 结构一致。

在支架区域里，GtFz1 wRNA 结构包含三个茎环，SL2 的远端和环区域与 SL4 形成广泛的相互作用，折叠在一起，发现保守的氨基酸 R85 对 DNA 结合至关重要。此外，GtFz1 中的氨基酸 F392、SpuFz1 中的氨基酸 Y345 以及 PpFz1 中的氨基酸 R448 与 DNA 靶向临近基序（Target-adjacent Motif, TAM）中 TS 的最后一个碱基形成堆叠的相互作用。

来源：Cell

研究思路：通过对同源蛋白家族的模型分析，结构比对和生化功能分析蛋白的共同特征和区别，为解析 Fanzor 如何调控自身以激活 DNA 切割活性做深入探索。

3. 局部构象变化调控 Fanzor 对目标 DNA 的操作

那么，GtFz1、SpuFz1 和 PpFz1 三个蛋白对于目标 DNA 的操作有什么区别吗？研究团队发现 GtFz1 的催化三联体中出现了非典型的 N 残基，能够增强了其体外 DNA 切割活性。PpFz1 中的一个独特结构域能够与一种被称为亲环蛋白（Cyclophilin）的蛋白质结合，提示其可能在寄主生物的生理功能中具有重要的作用。

值得一提的是，在 GtFz1 中，未结合 DNA 的状态以及两个结合了不同形式 DNA 的结构展示了 REC 结构域在 R-loop 形成和稳定中的关键构象变化。在 SpuFz1 和 PpFz1 中，研究解析了具有不同数量 Guide/DNA 碱基配对的结构，揭示了 RuvC 结构域中的一个环状结构。三种结构细节上的区别揭示了 Fanzor 如何调控自身以激活 DNA 切割活性。

来源：Cell

研究思路：通过解析不同 DNA 结合构象的结构，发现数个蛋白复合物间的特异性，刻画 DNA 切割的全过程细节，宏观地展示 Fanzor 的结构多样性和 DNA 切割机制。

研究总结与展望

总之，本研究再次加深了对基因编辑系统的探索，张锋院士团队通过来自不同物种以及不同 DNA 结合构象的 Fanzor 蛋白结构分析，揭示了该家族蛋白的分子多样性，并揭示了 Fanzor 蛋白的激活机制，为未来基因编辑工具的设计增添了浓墨重彩的一笔！

通讯作者：（上下滑动查阅）

张锋，1982 年出生于河北，21 岁获得哈佛大学化学与物理学学士学位，26 岁获得斯坦福大学化学及生物工程博士学位，34 岁拿到麻省理工（MIT）终身教授，担任麦戈文脑科学研究所研究员、博德研究所研究员。美国国家科学院院士、美国国家医学院院士、美国艺术与科学院院士、美国国家发明家科学院院士，主要从事生物工程及大脑认知科学的研究，是国际公认的 CRISPR-Cas 基因编辑技术先驱之一。凭借在脑科学及基因编辑领域的突出贡献，张锋收获了不少重磅国际大奖，包括美国国家青年科学家最高荣誉 Alan T. Waterman Award（2014）和美国生物医学最高类奖项之一 Albany Medical Center Prize（2017）。

参考文献

1. Saito, M., Xu, P., Faure, G. et al. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature 620, 660–668 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2

2. Xu et al., Structural insights into the diversity and DNA cleavage mechanism of Fanzor, Cell (2024), https://

doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.050

3.https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(24)00624-5

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