mRNA肺癌疫苗的幕后英雄：T7 RNA聚合酶

8 月 24 日消息，全球首款mRNA肺癌疫苗——由拜恩泰科（BioNTech）公司开发的BNT116正式在全球7个国家和地区启动临床试验，这标志着人类在癌症治疗策略上的又一重大进步。

根据世界影响因子最高的学术期刊《CA: A Cancer Journal for Clinicians 》发布的2020年全球癌症负担数据，肺癌是全球癌症死亡的主要原因，在185个国家和地区中是男性死亡病例排名第一的癌症，在89个国家中占据首位。

肺癌通常分为两大类：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中非小细胞肺癌约占80%～85%，BNT116正是专为抗击非小细胞肺癌 (NSCLC) 而设计，这种尖端疫苗采用了mRNA技术。

随着生物技术的飞速发展，mRNA疫苗作为一种新型的生物制剂，在疾病预防和治疗中展现出巨大的潜力。mRNA 疫苗本身不含有完整的病毒，其主要根据病毒的基因序列使用体外转录合成开发出新型候选疫苗。其中，T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase）作为mRNA生产过程中的关键酶，其高效性和特异性在mRNA疫苗的生产中起到了至关重要的作用。本文将从T7 RNA聚合酶的基本特性出发，探讨其在mRNA疫苗生产中的具体应用。

mRNA疫苗的生产流程

基因序列的选择

mRNA疫苗的设计始于对病原体（例如病毒）的特定基因序列的分析。科学家们识别出关键的蛋白质编码区域，通常选择病毒表面蛋白，因为它们是免疫系统识别的主要目标。

体外转录合成

一旦确定了目标基因序列，科学家们利用体外转录技术在实验室中合成mRNA。这一过程使用病原体的基因序列作为模板，合成出携带制造特定蛋白质指令的mRNA分子。

递送系统封装

为了保护mRNA分子在体内不被迅速降解，并且确保它们能够有效地传递到人体细胞，mRNA分子被封装在特殊的递送系统中。这些系统通常由脂质纳米颗粒构成，它们有助于mRNA分子的稳定和细胞内传递。

候选疫苗的制备

封装后的mRNA分子成为候选疫苗的一部分。在这一阶段，候选疫苗将经过一系列的质量控制检测，确保其安全性和功能性。

T7 RNA聚合酶在mRNA疫苗生产中的应用

mRNA的转录

T7 RNA聚合酶是一种由T7噬菌体DNA编码的酶，具有高度的启动子专一性，专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。其分子量约为99kDa，对T7启动子序列具有高度特异性，只识别并转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA或DNA复制品。在合成RNA的过程中，T7 RNA聚合酶需要DNA模板与镁离子（Mg²⁺）作为辅因子，且其活性可被亚精胺（speremidine）促进。此外，T7 RNA聚合酶不受抗生素利福平（Rifampicin）的抑制，这使得它在工业生产中具有更高的稳定性和可控性。

mRNA的转录是T7 RNA聚合酶在mRNA疫苗生产中直接发挥作用的关键步骤。在无细胞的反应器内，以DNA模板为底物，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录。转录过程中，T7 RNA聚合酶识别T7启动子并启动RNA的合成，同时以NTP（核苷酸三磷酸）为底物，合成与DNA模板互补的mRNA。此外，还需无机焦磷酸酶、 Rnase Inhibitor、加帽酶以及 2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和 DNAase 等参与反应。如加帽酶和 2′O-甲基转移酶能在mRNA的5'端添加甲基化的鸟苷酸帽子（Cap结构）；Poly(A)聚合酶在3'端添加多聚腺苷酸尾巴（Poly A尾巴），以增强mRNA的稳定性和翻译效率。

T7 RNA聚合酶在mRNA疫苗生产中的优势

高效性

T7 RNA聚合酶具有极高的转录效率，能够在短时间内合成大量mRNA，满足工业化生产的需求。

特异性

T7 RNA聚合酶仅识别T7启动子，避免了非特异性转录的干扰，提高了mRNA的纯度和准确性。

灵活性

通过基因工程技术，可以方便地调整DNA模板中的基因序列，从而实现对mRNA疫苗抗原的精准设计和优化。

安全性

T7 RNA聚合酶在体外进行转录，避免了病毒复制的风险，提高了疫苗的安全性。

不过，尽管T7 RNA聚合酶能够从DNA模板合成RNA分子，但目前普遍还存在一些性能上的局限。

例如，在体外转录过程中，T7 RNA聚合酶可能产生双链RNA（dsRNA）副产物，这些dsRNA分子能模拟病毒基因组，激活细胞免疫反应，即使微量也会引发细胞毒性，影响药效和安全性。此外，T7 RNA聚合酶在转录过程中还可能产生非模板的附加物，这需要额外的纯化步骤来从最终的mRNA产物中去除dsRNA，增加了生产成本和复杂性。

为了解决这些问题，研究人员设计和开发了新的技术方案，例如，提高IVT温度可减少产物中的dsRNA[1]，常规T7 RNA聚合酶在高温环境下会迅速失去活性，导致转录反应无法持续进行，而通过蛋白质工程改造是改善酶热稳定性的关键手段。国内外已有多家企业正着力于定向进化出耐高温的T7 RNA聚合酶，以提高T7 RNA 聚合酶在高温下的转录活性。目前市面上的耐高温T7 RNA 聚合酶已经可以在54℃环境下工作。

通过优化T7 RNA聚合酶介导的转录反应，结合先进的纯化技术和制剂工艺，可以高效地生产出高质量的mRNA疫苗。随着mRNA技术的不断发展和完善，T7 RNA聚合酶在mRNA疫苗生产中的应用前景将更加广阔。

除了mRNA疫苗外，T7 RNA聚合酶还被广泛应用于其他核酸药物的体外合成。这些核酸药物包括反义RNA、siRNA（小干扰RNA）、miRNA（微小RNA）等，它们通过特定的机制在细胞内发挥治疗作用。T7 RNA聚合酶能够高效地催化这些核酸药物的合成，为药物研发提供可靠的技术支持。

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[1] Dousis, A., Ravichandran, K., Hobert, E.M.et al.An engineered T7 RNA polymerase that produces mRNA free of immunostimulatory byproducts.Nat Biotechnol41, 560–568 (2023).