分析 qPCR 数据，竟被导师冤枉在实验室「炒股」

谁懂啊，好不容易加班加点把 qPCR 跑完，分析数据时导师路过了，他一句话没说，转头竟在大群里发消息说不要在工位上做一些与实验无关的事，例如看股票。师兄师姐闻讯赶来，看着我的结果图哈哈大笑。

师兄

师弟，今天「股市」行情如何呀？

不太行…… 我的 qPCR 到底哪里出问题了呢？

师弟

师姐

你的熔解曲线出现双峰，这一般是引物非特异扩增导致的。

师兄

正好过两天有个 qPCR 课程，从原理到数据解析都会讲到，咱们可以一起学一学！

天根生化将于 9 月 12 日 15:00 开展线上专题直播课程「荧光定量 PCR 技术与 MIQE 金标准」，从原理、实验流程到 qPCR 数据分析及结果准确性因素剖析，手把手教学 qPCR 实验技巧，无论你是基础小白还是经验丰富的老手，此次课程都会让你有所收获，让你的 qPCR 技能更上一层楼。此外，参与直播还有机会赢取计时器、保温杯等精美好礼！

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直播亮点

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qPCR 原理全解析

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1）荧光定量 PCR 常见标记方法：SYBR Green I 染料标记、TaqMan Probe 标记

2）荧光定量 PCR 常用名词概念

扩增曲线：qPCR 过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标，以反应过程中实时荧光信号所做的曲线。

▲ 应为平滑的 S 型扩增曲线，阳性结果（科研）理想的 CT 值范围：15 35；技术重复之间的 CT 差异 < 0.5。

熔解曲线：指随温度升高 DNA 的双螺旋结构解链程度的曲线。分析该曲线可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。

▲ 熔解曲线应有单一锐利的峰，mRNA：Tm 值在 80～90 ℃；miRNA : Tm 值在 70～80 ℃。

Ct 值：PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

2

qPCR 数据计算方法举例、实例分析

1）绝对定量解析方法

Log（起始浓度）与循环数（CT 值）呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品，可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。

根据待测样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量。

2）相对定量解析方法

1. 目的基因 Ct 值的归一化：

ΔCt（实验组）= Ct（实验组的目的基因）- Ct（实验组的管家基因）

ΔCt（对照组）= Ct（对照组的目的基因）- Ct（对照组的管家基因）

2. 实验组 ΔCt 的归一化：

ΔΔCt = 各样本的 ΔCt - 对照组的 ΔCt

3. 表达水平的差异倍数：2–ΔΔCt

3

影响 qPCR 结果准确性的因素：RNA、反转录、数据分析等。

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内容策划：沈佳钰

内容审核：钟可可

题图来源：自己做的