动物模型与评估丨渐冻症动物模型构建与评估

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ALS动物模型:

肌萎缩侧索硬化症（ALS）又称渐冻症，相关动物模型是研究ALS的病因、病理、发病机制和治疗的重要工具。目前建立ALS的啮齿类动物模型主要是SOD1、TDP-43、VCP、FUS、ALSIN等基因的不同突变体和采用不同启动子的转基因大小鼠或基因敲除小鼠，还包括Wobbler小鼠自发突变ALS易感品系，以及免疫原诱发的豚鼠ALS模型(表2)。自发突变ALS易感品系Wobbler小鼠是50年前建立的ALS模型，现在仍然广泛使用。hmSOD1-G93A突变基因转基因小鼠是目前应用最广泛的ALS模型，比较客观的反映氧化应激对运动神经元的损伤机制。

Table1 ALS啮齿类模型

①Wobbler鼠：

是研究得最多的鼠类模型。出生3～4周后逐渐出现前肢无力，可长到成年而在1年左右死亡。病理学发现脊髓前角细胞中近端轴突变性及空泡改变，提示疾患可分类为轴突病及神经元病，此型鼠的脑很少受损。已知为11号染色体缺陷常染色体隐性遗传，但责任基因尚未被识别。

②进行性MND鼠：

为常染色体隐性遗传表型，确切基因缺陷未明，已知位于13号染色体。于出生后3周开始骨盆肌及后肢无力，6～7周龄即死亡，病理学特征为远端运动轴突病变（粒状内质网解体）而躯体运动神经元（MN）相对未受累，类似人类ALS的病理改变。

③MND鼠：

表现为5～11月龄出现后肢僵硬、萎缩及麻痹，存活常不超过14个月。病理学见脊髓、舌下核及运动皮质ＭＮ退变伴神经元肿胀及有胞浆包涵体并溶酶体异常，并有严重的视网膜变性。缺陷基因未明，属8号染色体的常染色体显性遗传。

④神经肌肉变性（NMD）鼠：

为19号染色体的常染色体隐性鼠模型。表现为2周龄开始后肢快速进展无力，存活很少超过4周。病理学见腰髓MN胞体退变。NMD鼠的基因缺陷为单个氨基酸缺失及在编码一表达ATP酶／DNA螺旋酶基因中剪接供体位点突变，即已知的SMbp2。

SOD1及G93A鼠模型:

铜（Cu）／锌（Zn）超氧化物歧化酶（SOD1）突变与15％～20％的人类家族性MND有关，后者为常染色体显性遗传病，与染色体21q22．1及21q22．2基因突变相关，迄今已有100种以上的突变被特性化。SOD1是广泛表达的蛋白质，代表CNS中总细胞蛋白质含量的约1％。SOD1为有Cu／Zn结合基的金属酶，其在细胞中作为同质二聚体起作用。突变的SOD1在NF蛋白的异常聚集使轴突传输减慢并导致畸变的细胞骨架病变而引发MND。SOD1转基因突变动物模型有多种，其中以93位甘氨酸（Gly）突变为丙氨酸（Ala）的G93A鼠是目前研究ALS中使用较多的模型，其运动行为及病理变化与人类ALS极为相似。

行为学测试：

从第8周开始每天进行一般状况评分，评分标准参考Vercelli等人研究的1-5分评分法：

• 5分：无运动功能障碍

• 4分：将小鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤

• 3分：明显的后肢无力、步态异常

• 2分：双后肢完全瘫痪，爬行仅靠前肢。

• 1分：双后肢完全瘫痪，并且将小鼠仰卧后20s内不能翻转。

转棒实验

将每只小鼠放在转棒疲劳测试仪的转棒上,旋转速度最大为25r/min(实验前,每只小鼠训练3天,每天2次,以180s为分界值)。实验重复3次,每次测试间隔至少1h。取每只小鼠平均坚持时间。坚持时间越长,小鼠耐力和平衡能力越强。

步长测量

采用步行追踪分析系统(VisuGait)进行测试。将实验小鼠放置于避光步行通道中(宽5cm),视频采集系统在步行通道下方,对准小鼠经过的通道显示出小鼠足迹。实验时让小鼠自然进入步行通道,高速摄像机连续记录至少3个步行周期的视频进行后续的数据分析,小鼠中途不能有停顿时间,否则重新记录小鼠步行视频。

抓力测试

将小鼠轻放于仪器抓板的中央,等小鼠抓稳抓板后,均匀用力轻轻地拉小鼠尾巴。每只动物测试3次,取3次结果最大值。抓力值越大说明四肢肌肉力量越大。

悬挂测试

每只动物被放置在一个60cm×40cm的金属网中央。等小鼠抓紧金属网后,将其旋转180°呈倒置水平。记录小鼠挂在金属网格上的时间(小鼠在测试前均进行了训练,设定180s为测试时间上限)。每只重复实验2次,取每只小鼠平均悬挂时间。悬挂时间越长,小鼠四肢的抓取力越大。

爬杆测试

将一根长约50cm、直径约1cm自制木杆用医用纱布缠绕以增加摩擦。将小鼠头朝下放在垂直杆的顶部,记录从杆顶到底部平台的下降时间。在测试前,每只小鼠连续训练3天,每天2次,分界值为15s。实验过程重复3次,计算每只小鼠平均爬行时间。爬行时间越短,小鼠的运动和协调能力越强。

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旋转实验

第9周开始转棒实验，实验前5天为转基因鼠的适应和学习阶段，以后每周测一次。转棒仪从1转/分开始，3分钟内达到15转，记录下小鼠在滚轴上持续运动不掉落的时间（以秒计数），取最长的一次记录。

悬绳试验

本试验用来评估小鼠的肌力，在小鼠转棒后一天检测。将小鼠倒挂在高60cm，底层铺有柔软垫料的笼子盖上，记录小鼠倒挂的最长时间，检测三次记录最长时间。

文献引用：

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