动物模型与评估丨脑出血（ICH）模型和评估

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采用Ⅶ型胶原酶注射诱导小鼠的ICH模型。简而言之，用0.3%戊巴比妥钠（60mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，然后将其置于立体定位架上。头皮和尾部消毒，头部沿矢状缝切开，逐层分离头皮、筋膜、骨膜，暴露颅骨。微量注射器吸取0.5μL胶原酶，在2min内匀速注入右侧纹状体（坐标：前囟后0.5mm，矢状缝右侧2mm，深度4mm）。针头在该位置停留了5min，以防止回流。然后上调1mm，再留针5min。最后，出针后用骨蜡封住颅骨孔，缝合头皮并进行消毒。Sham组接受了同样的手术，并注射了等量的生理盐水。

神经行为学评分为了监测小鼠基底节出血后的神经功能，在小鼠术后采取一系列行为学测试分为感觉运动功能测试。

加西亚评分

用于对小鼠进行神经行为评分。评分标准包括：自主活动的程度，左侧肢体感觉，左侧肢体偏瘫，对触须的感觉，提尾时左前肢伸不直，向左环行，抓握能力等。以上指标无异常为3分，轻度异常为2分，中度异常为1分，严重异常为0分。各项评分相加，总分为21分。术后24小时进行该实验并记录实验结果，进行统计分析。

转角实验

感觉功能的缺失是对小鼠神经功能判定的一个可靠的指标，目前常用的即为转角实验。具体操作是将两个尺寸为30cm＊20cm的塑料板制成呈30°的夹角，将小鼠置于夹角之间，进入夹角深部，双侧的触须受到刺激后会站立并转身面向夹角开口端。正常小鼠从右面或左面转身的概率基本相等，而一侧脑损伤的小鼠会优先向脑损伤侧转身。术后24小时进行该实验并记录实验结果，进行统计分析。

前肢放置实验

将小鼠握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10cm处向桌面缓慢斜线靠近，小鼠正常反应为前肢即刻抓向桌面记1分，而损伤小鼠则表现为肢体反应延迟，记0分。术后24小时进行该实验并记录实验结果，每只小鼠重复实验10次，总计0-10分。

疲劳转棒实验

用于测试小鼠基底节区出血后的运动功能。小鼠被放置于一个橡胶短棒上，随着实验开始随着短棒的旋转而跑动，橡胶短棒的速度由初始的5转每分钟在300秒内匀速提升至40转每分钟，小鼠从短棒上掉落的时间（latency）将被记录。实验于手术前3天开始，每天5次，每次间隔10分钟，手术前1天的实验将记录结果，取后三次平均值记录为小鼠的术前基础值，手术后每个检测时间点都同样方式记录5次结果，取后3次平均值为当日该鼠结果。

踏空实验

用于测试小鼠基底节区出血后的协调运动能力。将小鼠置于铁丝网格平台上，网眼大小为2.3ｃｍ＊2.3ｃｍ，记录小鼠在1分钟内前肢总共踏出的步数以及患侧前肢踏入网眼的次数（即踏错步数）。实验于手术前２日开始，每日１次，将小鼠置于平台上行走1分钟，手术前1日记录总步数及踏错步数，并计算术前基础值，计算公式为踏错步数／总步数。

Morris水迷宫

用来评价动物空间学习记忆能力。术后7-14天，进行水迷宫实验评价小鼠的学习记忆能力。水迷宫四个象限均贴有标记以便小鼠记忆。将牛奶倒入水迷宫圆筒中，保持水面不清澈且无泡沫等杂质，水温适宜（22-25℃）。第1天为可见平台期，平台水上1cm可见，将小鼠从不同象限头朝池壁放入。放入位置为由东、西、南、北构成的东北（NE）、东南（SE）、西北（NW）、西南（SW）四个象限。实验人员放入小鼠后立即退出并拉上帘子，保持环境安静无噪音。记录小鼠从放入水中到找到平台的时间，让小鼠适应找到平台的状态。如果在60s内未找到平台，则引导至平台，让其在平台上停留10s再移开，擦干，每只小鼠均训练四个象限，每次训练之间间隔30min以上。第2-6天，将平台降至水下1cm，使平台隐藏，固定平台位置，将小鼠从第一天象限的对侧象限头朝池壁放入，记录小鼠的逃避潜伏期（即入水后第一次找到水下平台的时间）、穿越平台次数、平台象限时间、游泳距离等。如果在60s内未找到平台，则引导至平台，让其在平台上停留10s再移开，擦干，每只小鼠均训练四个象限，每次训练之间间隔30min以上。第7天将平台撤出，从平台象限对侧象限放入小鼠，同样记录小鼠的逃避潜伏期（即入水后第一次找到水下平台的时间）、穿越平台次数、平台象限时间、游泳距离等，每只小鼠记录60s。

24分的神经功能缺陷量表

主要用于评价小鼠的神经功能缺损症状，反应动物瘫痪程度及运动能力。该评价方法简单，易行，不需要任何仪器设备，但容易受到环境及主观因素影响，在本实验开始前，评估人员已经经过培训，达到评估人员与培训人员进行5次评分一致性评价，每次评价5只小鼠，在与培训人员对同一只左侧纹状体ICH小鼠神经功能缺损评分误差不超过1分认为培训合格，该评估人员方可参与动物评估。该评分量表共分为6项，分别是身体平衡性，前肢对称性，步态，转圈行为，攀爬，强迫旋转，每项计分0-4分，最大分数共计24分，分数越高，表示神经功能缺损越重。记录者及结果分析者遵守盲法原则，对实验分组及术后测评时间均不知晓。

悬挂实验

也是用于评价小鼠的神经功能缺损严重程度，尤其是前肢的抓握能力，平衡能力、运动耐力及协调性。准备一段55cm长，1mm粗的铁丝，固定在两个距离55cm的铁杆上，距离地面的高度是50cm。在铁丝下方放置一个软枕，避免小鼠掉下时摔伤。把小鼠后肢用胶布黏贴起来，避免四肢活动及逃跑，让小鼠前肢抓握铁丝，用前肢吊起自身的重量，记录小鼠能够抓握铁丝的持续时间，抓握时间越长，表明该动物的神经功能缺损越轻，肢体瘫痪越轻，运动耐力及运动协调能力越好。在正式实验前一天，让小鼠尝试抓握铁丝吊起自身重量３次，使小鼠尽可能掌握该实验中的抓握技巧。

新物体识别实验

主要用于评价动物对新鲜事物的记忆能力和对新事物的探索能力。实验前准备3样物体分别标记为A，B，C，其中A和B大小，形状及颜色相同（定义为旧事物），如同为红色方框（大小4cmＸ4cmＸ3cm），而C为与A、B完全不同，包括形状，大小和颜色（不规则型，直径5cm）（定义为新事物），同时备一个47cm（长）Ｘ26cm（宽）Ｘ20cm（髙）的旷场，备摄像系统一套，记录整个实验过程。实验过程分为三个阶段：第一阶段为适应阶段，在实验第1天，动物放于旷场内自由活动10分钟，旷场内不放置任何物体，每一只动物适应后，都用酒精彻底清洁，消除异味。第二个阶段为实验阶段（1）训练阶段：该实验设在适应阶段的第2天，旷场内放置物体Ａ和物体B，把动物放置于A和B之间，允许动物自由探索5分钟，然后把动物放回笼子休息1小时。第三阶段为实验阶段（2）测试阶段：在第二阶段后1小时进行，把物体B换为物体C，再次将动物放在A和C之间，允许动物自由探索5分钟，动物移动行为被摄像机全程记录并作为后续分析。动物用鼻子和/或前爪在物体周围0.5cm内嗅或触碰被定义为探索事件。动物靠在物体上或在蹲在物体上休息及动物在旷场内物体0.5cm以上的距离自由活动均不记录为探索事件。记录小鼠对新旧事物的总探索时间和辨别指数（Discrimination Index, DI）。总探索时间S总＝S（探索物体Ａ时间）＋S（探索物体Ｃ时间）。DI的计算方法是：DI＝探索物体Ｃ的事件/探索Ａ的事件＋探索Ｃ的时间。

Y-maze实验

主要用于评估动物的空间记忆能力及其主动探索欲望。实验前准备设施为一个Ｙ型迷宫及摄像系统。Ｙ迷宫有三个臂组成，每个臂参数30cm（长）Ｘ10cm（宽）Ｘ17cm（高），每个臂之间成120°角，分别标记为Ａ、Ｂ、Ｃ。需要摄像设备全程记录小鼠的活动情况。实验开始，动物被放置于三臂交叉的中间区域，允许小鼠自由活动于三个臂5分钟，记录小鼠进入每个臂的次数及成功轮转次数（连续轮状不同臂Ａ、Ｂ、Ｃ为一个成功循环），记录总进臂总次数和成功轮转次数，交替指数（Alternation Index, AI）百分数＝（成功轮转次数／进臂总次数-2）ｘ100％。小鼠整个身体及四肢均进入一个臂才计为一个成功的进入。每只小鼠实验结束后，均要用酒精彻底清洁，消除异味。

旷场实验

主要用于评估小鼠的运动功能和焦虑情绪。应用红外线追行踪系统置于旷场盒的上方，保证摄像机可以完整探测到旷场底部每一个小正方形。连接红外线追踪系统与电脑分析软件。动物置于旷场中间部分，让其在矿场内自由活动10分钟，用红外线追踪系统记录其运动轨迹。观察及比较不同组别的运动轨迹图，分析动物的平均运动速度及在10分钟内运动的总距离，同时分析出现于中间区域及周边区域的时间。

强迫游泳实验

主要用于评价动物的抑郁情绪及在危险环境下其逃生欲望的强弱。实验前准备一个20cm（高）Ｘ22cm（直径）的透明圆柱体透明容器，内放入25±0.5°Ｃ自来水至容器高度约15cm处。由于该实验为强迫动物游泳的行为，可能给动物带来行为上的绝望而影响后续行为学检测的结果。该实验设在各模型组动物手术后21天进行，且是所有行为学评估的最后一个实验。每一组动物只进行一次该实验。实验前2-3个小时把动物放置于游泳实验室内适应环境。实验时把动物放置于容器中间，让小鼠自由活动并用录像机记录动物的活动过程共计6分钟。小鼠游泳6分钟内分两个阶段，前2分钟作为适应时间，几乎所有动物均处于逃跑及挣扎状态，而后4分钟各组动物容易出现有差异的游泳行为，记录后4分钟内小鼠不动的时间作为结果分析指标。实验过程中保持安静，减少对动物的刺激和惊吓。每只动物实验结束均需要重新换水，且保证每只动物游泳水的温度一致，每只动物实验结束后除换水，尚需要用酒精彻底清洁玻玻璃缸，消除上一只小鼠可能残留的异味。实验结束后立即用干毛巾擦干小鼠身上水分，并用暖风机吹干。所有组别模型鼠均在术后21天进行强迫游泳实验。记录者及结果分析者遵守盲法原则。

参考文献：

1、Injury mechanisms in acute intracerebral hemorrhage[J]. D. Andrew Wilkinson;;Aditya S. Pandey;;B. Gregory Thompson;;Richard F. Keep;;Ya Hua;;Guohua Xi.Neuropharmacology,2018

2、Inhibition of stress fiber formation preserves blood–brain barrier after intracerebral hemorrhage in mice[J]. Anatol Manaenko;;Peng Yang;;Derek Nowrangi;;Enkhjargal Budbazar;;Richard E Hartman;;Andre Obenaus;;William J Pearce;;John H Zhang;;Jiping Tang.Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism,2018

3、张俊毅.Bar501激活GPBAR1在脑出血小鼠模型中的抗炎作用及机制研究[D].苏州大学,2021.

4、王丽敏.重复脑出血模型的建立与远隔中脑多巴胺神经元损伤机制的初步研究[D].南方医科大学,2023.

5、李腾.补阳还五汤通过miR-760-3p/GPR17促进脑出血后髓鞘修复[D].中南大学,2023.

6、An Update on Inflammation in the Acute Phase of Intracerebral Hemorrhage[J]. Sheng Chen;;Qingwu Yang;;Gang Chen;;John H. Zhang.Translational Stroke Research,2015(1)

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