Nature︱解码RAS剂量效应：改变肿瘤衰老状态和影响肿瘤发生

撰文 | 咸姐

细胞衰老与生理和病理过程有关，包括发育、伤口愈合、器官功能随年龄增长的衰退以及癌症。衰老细胞的特征是细胞周期的延长和功能改变 （这种细胞功能的变化可以表现为丧失、获得和/或增强） ，其处于稳定地停滞生长状态，产生一种复杂的分泌蛋白质组 （被称为与衰老相关的分泌表型，SASP） ，并经历包括转录、表观遗传、形态和代谢变化在内的特征性改变。衰老是一种由分子损伤触发的细胞应激反应，这种损伤可能由复制性耗竭、异常的癌基因激活或化疗药物治疗引起【1,2】。

某些癌基因，如RAS的异常激活可以导致细胞衰老，这种现象被称为癌基因诱导的衰老（Oncogenic RAS-Induced Senescence,OIS） ，这是细胞对癌基因激活的一种防御机制，防止细胞不受控制地增殖，是一种与恶性肿瘤前期相关的自主肿瘤抑制机制【2】。RAS是人类癌症中经常发生突变的基因，但仅靠一个致癌RAS等位基因本身并不足以引发癌症的发展；相反，进一步增加突变RAS及其下游效应子 （如MAPK途径） 的活性似乎是必要的。研究发现，OIS通常需要过度的RAS活动【3】，但低致癌剂量引起的表型尚不清楚，OIS与肿瘤发生之间的关系仍然难以捉摸，它与正常或未转化的二倍体细胞环境中的致癌RAS的水平是否有关呢？

近日，来自英国剑桥大学的Masashi Narita团队于Nature上在线发表题为Titration of RAS alters senescent state and influences tumour initiation的文章，通过体外和体内模型，揭示了RAS基因剂量递增对肿瘤发展的影响，发现NRAS (G12V)表 达水平与肝细胞OIS表型和肿瘤免疫清除有关，证明不同NRAS (G12V) 水平导致不同肿瘤类型，与人类肝细胞癌（HCC）亚类相关，重新定义了由致癌剂量驱动的OIS谱系，调和了早期肿瘤发生中的衰老和肿瘤发生表型。

本文研究人员首先构建小鼠肝脏模型，通过流体动力尾静脉注射 （HDTVi） 稳定地传递含有致癌NRASG12V的转座元件，使转基因被一部分肝细胞吸收。注射后第6天 （免疫清除前） 对RAS进行免疫组化 （IHC） 分析，结果显示肝细胞出现NRAS表达水平的显著异质性。随后，研究人员对流式分选后的肝细胞进行单细胞测序 （scRNA-seq） ，以探索NRAS剂量的异质性是否转化为单细胞水平上的下游转录组差异。分析结果显示，根据NRAS表达量的不同，肝细胞分化为具有OIS特征或祖细胞样特征的多个群落。伪时间分析显示，NRAS的表达水平与细胞群落的进展密切相关，NRAS剂量是细胞群落形成的主要驱动力。此外，研究还观察到与衰老相关的基因表达水平与NRAS剂量呈线性相关，而SASP基因的表达则在不同群落中表现出异质性，由此表明OIS在体内的异质性及其与NRAS剂量的依赖性。与此同时，利用不同的癌前病变模型，研究人员也证实致癌性RAS诱发了一种剂量依赖的、非线性的表型谱。

为了更系统地探索对RAS不同水平的反应，研究人员开发了一种体外和体内系统，用于滴定细胞中表达的异位RAS的剂量。对于这两种系统，均在相同的开放阅读框内共表达了荧光标记mVenus和突变型RAS，并由P2A （一种自切割肽，能够在共翻译过程中介导切割成各自组成的蛋白质） 分开。考虑到RPE1细胞对流式分选压力有抵抗力且能维持二倍体核型，研究人员利用其进行体外实验来研究RAS基因如何影响细胞周期。他们构建了一个包含诱导型ER–HRAS(G12V)融合蛋白的预测报告系统，并通过4-羟基他莫昔芬 （4-OHT） 的添加来控制HRAS(G12V)的表达。实验结果显示，低水平的HRAS (G12V) 表达有助于RPE1细胞保持增殖能力，而高水平的表达则导致细胞衰老标志物的增加和细胞周期进展的减少。此外，尽管高RAS表达的细胞群体中细胞增殖能力下降，但仍有部分细胞保持了增殖能力，表明在RAS诱导的衰老样状态下，细胞的增殖状态是异质性的。由此显示了RAS基因剂量对RPE1细胞衰老和细胞周期进程的非线性剂量依赖性影响，并揭示了RAS诱导的衰老样状态与细胞增殖能力降低之间的关系。

随后，为了直接研究亚OIS剂量致癌RAS在体内的长期影响，研究人员在小鼠肝脏模型中应用了上述剂量滴定策略。通过使用不同强度的启动子来调控RAS蛋白的表达水平，IHC结果显示使用较弱的启动子 （PGK和UBC） 相比于强启动子 （CAGGS） 能够产生更低且更均匀的NRAS表达水平。研究人员发现，在PGK-NRAS (G12V) 或UBC-NRAS (G12V) 小鼠中，免疫细胞的募集减少，这与低表达NRAS的肝细胞的免疫逃逸有关。同时，低剂量的致癌性RAS有助于肿瘤发生，这不仅是通过减弱免疫介导的清除，还可能是通过获得细胞自主变化，例如增加的可塑性。此外，scRNA-seq分析显示，在低NRAS表达的细胞中，存在一个细胞群，这些细胞高表达肝母细胞标记物，如Dlk1和Afp，并伴随着肝细胞标记物的上调，表明这些细胞可能代表肿瘤发生状态。由此表明在亚OIS条件下，致癌性RAS的剂量对肿瘤发生具有重要影响，并揭示了不同RAS表达水平下的细胞状态与肿瘤发生的潜力。

为了进一步探索在亚OIS条件下，不同剂量的致癌性RAS如何导致至少两种不同的肿瘤发生事件，研究人员分析了注射不同剂量NRAS (G12V) 的小鼠发展出的肿瘤，特别是PGK-NRAS (G12V) 或UBC-NRAS (G12V) 模型，评估了肿瘤的分化程度，并将其与肿瘤发生的潜伏期相关联。实验结果显示，早期发生的肿瘤多为未分化，具有多形性肿瘤细胞和肉瘤样特征，这些肿瘤细胞通常表达CK19，但缺乏胆管癌的特定组织学特征。晚期发生的肿瘤则为更分化的HCC，这些肿瘤细胞通常不表达nestin/NOTCH1。研究人员发现，相对高水平的RAS可以诱导衰老或祖细胞样状态 （Notch1和Nes） ，导致侵袭性未分化肿瘤，而低水平的RAS诱导明显的祖细胞样状态 （Dlk1, Gpc3和Afp） ，发展成分化程度更高、潜伏期更长的HCC。

最后，研究人员探究了上述发现与人类肝脏肿瘤的相关性。研究结果显示，小鼠中的肿瘤细胞根据其分化程度和特定的分子标记 （如NOTCH1、nestin、Dlk1） 与人类HCC的早期或晚期亚类呈现出显著的基因表达相似性。通过Kaplan-Meier分析发现，与特定HCC亚类相关的基因特征能够预测患者的预后，特别是对于分化较差的HCC亚类，通过增加在小鼠模型中发现的基因，可以提高这些亚类特征的诊断准确性。此外，研究者们在人类肝硬化患者中也观察到了与小鼠模型中相似的肿瘤发生状态，这表明这些状态可能在人类HCC的发展中也起着作用。由此证明小鼠模型中的肿瘤发生状态与人类HCC的特定亚类有着密切的联系，这为理解HCC的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要的线索。

综上所述，本研究提出的剂量滴定系统可以模拟非线性OIS谱系，包括衰老中间态，如慢周期 （如RPE1细胞） 和免疫抵抗的肿瘤发生状态 （如小鼠肝脏） ，这两种状态都以增加的祖细胞特征和降低的MYC信号为特征。通过体外和体内模型，本研究提供了关于RAS剂量相关衰老和免疫微环境演变的见解，揭示了至少两条通向肝脏肿瘤发生的不同路径，定义了由致癌剂量驱动的OIS谱系，为理解早期肿瘤发生中的衰老和肿瘤发生表型提供了新的视角，也为肿瘤的预防和治疗提供了新的策略。

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07797-z

制版人：十一

参考文献

1. Lee, S. & Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer.Nat. Cell Biol. 21, 94–101 (2019).

2. Birch, J. & Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.Gene Dev. 34, 1565–1576 (2020).

3. Chan, A. S. L. & Narita, M. Short-term gain, long-term pain: the senescence life cycle and cancer.Gene Dev.33, 127–143 (2019).

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